水蛭素具有抗凝血和抗血栓的作用

【背景及概述】^[1][2][3]

水蛭是我国传统中药中常用的活血化瘀通经的良药，始载于东汉时期的药物学专著《神农本草经》。水蛭素( hirudin) 是存在于水蛭唾液腺里的一种重要活性成分，1884 年 Haycraft 首先发现医用水蛭的提取物中含有抗凝血物质，1904 年 Jacoby 将其定名为水蛭素(Hirudin) ，1955年Markwardt 从医用水蛭咽周腺体中成功地分离出水蛭素纯 品。1986 年Harvey分离出水蛭素编码纯系 cDNA，从此利用基因工程技术制备重组水蛭素成为现实。它是一种目前已知的高效、特异的、最强的凝血酶抑制剂。

水蛭素是由65～66个氨基酸残基组成的小分子单链环肽化合物，相对分子质量为7000。水蛭素具有抗凝血和抗血栓的作用，其抗凝作用专一且抗凝活性强于肝素，是一种特异性最强的天然凝血酶抑制剂。水蛭素最开始应用于一些血栓性疾病，随着近年来人们对水蛭素研究的不断进展，其在抗凝、抗栓、抗炎、调脂、改善循环等方面的作用机制不断得到揭示，临床应用得到广泛扩展但由于受到地理位置、气候条件等因素的影响，天然水蛭素的产量不足、成本较高，临床研究及应用比较受限。随着基因工程技术的发展，现已制得多种重组水蛭素，克服了天然水蛭素来源困难等问题。

【结构】^[1][4]

天然水蛭素是一条含65或66 个氨基酸残基组成的单链多肽，分子质量为 7 kD，其N 末端有3对二硫键(Cys6-Cysl4，Cys16-Cys28，Cys32-Cys39)，使肽链绕叠成密集形核心环肽结构，对蛋白结构起稳定作用。其N 末端含活性中心，能识别底物—凝血酶碱性氨基酸富集位点，并与之结合。C 末端富含酸性氨基酸残基，最后9个氨基酸中有6个为酸性氨基酸。天然水蛭素第 63 位的酪氨酸残基被硫酸化，而重组水蛭素没有这个特殊的结构，因此后者抗凝比活性有所下降。水蛭素肽链中部有一个由 Pro-Lys-Pro 组成的特殊序列，不被一般蛋白酶降解，这有助于维持水蛭素分子的稳定性并引导水蛭素分子以正确的方向与凝血酶分子结合。

【药理作用】^{[1] [3]}

1. 抗凝

与肝素、枸橼酸纳等其他抗凝血药物不同，水蛭素抑制凝血酶活性不依赖任何辅助因子，它与凝血酶以非共价键的形式形成 1：1 不可逆的复合物，水蛭素与肝素及肝素-肝素辅因子Ⅱ抑制凝血酶活性的不同之处还在于水蛭素能抑制游离的和血栓中的凝血酶，与凝血酶绑定纤维蛋白裂解产物一样。另水蛭素与血浆蛋白没有相互作用，而肝素能结合血浆蛋白，可以解释肝素应用的局限性，如不能预测肝素的量效关系以及肝素效果的抵抗性。水蛭素阻止凝血酶产生的效果没有肝素强，但在抑制凝血酶激活方面比肝素强。水蛭素引起的出血或血小板减少等副作用明显少于肝素，正越来越广泛地被应用于治疗血栓形成的临床中。进一步研究发现水蛭素能通过阻断自然杀伤细胞逆转血小板对纤维蛋白素原的作用，从而产生抗凝血作用。水蛭素主要通过抑制凝血酶活性或影响血小板、自然杀伤细胞、单核细胞的活性和功能而产生抗凝血作用。

2. 抗血栓

凝血酶诱发的血液凝固是血管血栓形成的主要触发机制，它可使纤维蛋白凝固，激活血小板产生血小板凝聚，进而产生更多的凝血酶。研究发现水蛭素直接靶向凝血酶，能有效地防止纤维蛋白和血细胞结合形成血凝块，并且抑制游离的和凝血块上的凝血酶，因此可防止各血栓的形成及延伸。水蛭素能降低凝血过程中血纤维蛋白肽A 的减少，这种作用呈剂量相关性，反映水蛭素具有抑制凝血酶水解纤维蛋白原形成纤维蛋白的作用。水蛭素和肝素都能加快重组组织纤溶酶原激活物( rt-PA) 溶解富含血小板血栓，但是只有联合使用水蛭素能清除血管壁上残留的血栓。

3. 抗炎

通过观察水蛭素对大鼠随意皮瓣成活效果的研究表明，水蛭素与凝血酶以等摩尔比形成非共价键紧密结合的稳定复合物，并使之失活，从而有效地抑制炎症作用。研究表明水蛭素能够提高瘀血皮瓣局部超氧化物歧化酶水平、减少瘀血皮瓣局部丙二醛水平，减轻局部炎症反应。

【药代动力学】^[5]

动物研究表明，大鼠口服荧光标记水蛭素(FITC-rHV2)1h后血浓度达峰值，2～3 h逐渐降低,尿浓度大于血浓度。水蛭素口服吸收效果不佳，生物利用度低，气管内灌注仅少许吸收，但皮下注射吸收良好。主要经肾排泄。静脉注射分布半衰期为15～20 min，清除半衰期约为1～2 h。分别皮下注射重组水蛭素CGP39393 0.1、0.2、0.3和0.4 mg/kg，0.5 h后部分凝血酶原活化时间(APTT)延长值达高峰，24 h后基本恢复。

【临床应用】^[1][5]

1. 心脑血管疾病

通过观察尿激酶联合不同抗凝剂治疗 ST 段抬高型急性心肌梗死患者心脏超声指数，重组水蛭素组射血分数(EF) 、心输出量(CO) 及心脏指数(CI)显著高于低分子肝素组，表明重组水蛭素改善心功能效果更加显著；通过观察水蛭素注射液对脑梗死患者运动功能的影响，表明水蛭素可明显改善脑梗死患者的神经功能缺损评分，促进运动功能恢复；通过对高血压脑出血患者术中局部应用水蛭素，表明水蛭素能有效减轻脑水肿，改善患者神经功能，且应用安全、有效、可靠，不会增加迟发性出血的风险。

2. 急性弥漫性血管内凝血( DIC)

24 例男性健康志愿者静脉注射脂多糖( LPS) 2 mg/kg，诱发 DIC，随后分为实验组与对照组进行，治疗结果显示，对照组凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物(TAT) 和 D-D二聚体明显高于实验组，提示水蛭素有治疗 DIC 功效。

3. 皮肤瘢痕

研究发现水蛭素可能通过减少胶原产生来抑制增生性瘢痕，而减少胶原产生则是通过直接抑制增生性瘢痕成纤维细胞( HSFb) 的I、III型前胶原 m RNA 的表达来实现的；通过观察水蛭素对皮肤增生性瘢痕成纤维细胞 bF-GF 及 TGFp 表达的影响，表明水蛭素可下调 TGFβ1m RNA 和蛋白水平表达，同时上调 b FGF 的 mRNA 和蛋白水平表达，作用呈剂量依赖性，水蛭素对瘢痕有治疗效果；通过观察不同浓度水蛭素对体外培养 HSFb 的影响，表明水蛭素对HSFb 的增殖有抑制作用，水蛭素能增加 Bax 表达，抑制 Bcl-2表达，实验浓度水蛭素对 HSFb 有显著的抑制作用。

4. 肾脏疾病

瘀血、脂质代谢紊乱常见于肾脏疾病病人，而水蛭素能够降低蛋白尿，改善肾功能，降低血脂，具有抗凝、抗血栓形成、改变血液流变性、抗炎、抗增殖和抗纤维化等多种药理活性。通过观察水蛭素对 IgA 肾病患者的随机对照研究，表明水蛭素在降低 IgAN 血尿、蛋白尿和肾脏保护方面比潘生丁更具优势。通过对特发性膜性肾病治疗的回顾性分析， 认为水蛭素在降低尿蛋白速率、Ccr 上升速率方面均优于潘生丁，血浆黏度、纤维蛋白原、TC、TG 和 LDL 均显著下降( P<0.01) ，血浆白蛋白显著升高。糖尿病肾病和高血压肾病在微量白蛋白尿期，肾损害处于可逆阶段，早期治疗、延缓其进入显性蛋白尿期和肾衰竭期，具有重大的临床意义。研究表明，尿微量白蛋白与血管内皮损伤、胰岛素抵抗有关，也是全身血管内皮功能受损的一个重要标志；通过观察水蛭素对以尿微量白蛋白为主要表现的糖尿病肾病和高血压肾病患者的疗效，表明水蛭素可降低尿中微量白蛋白、改善高凝状况，对糖尿病肾病和高血压肾病患者的肾脏有较好的保护作用。

5. 抗肿瘤转移作用

水蛭素能抑制多种肿瘤细胞的生长和增值。提前给予水蛭素可抑制A549 人非小细胞肺癌和 MDAMB231 人乳腺癌细胞在裸鼠植入和生长，但并不抑制肿瘤接种 4~8 d 后的肿瘤植入和生长。水蛭素能延长尾静脉注射 A549 肿瘤细 胞 的实验性肺转移模型小鼠的存活期，抑 制B16F10 黑色素瘤细胞和 4T1 乳腺癌细胞在同源基因小鼠上的肿瘤植入和生长，能诱导 B16F10 黑色素瘤细胞和 4T1 乳腺癌细胞肿瘤结节坏死。水蛭素能减少绿色荧光蛋白（GFP）标签的 B16F10 移植肿瘤细胞进入血液，减少自发性转移模型肺部结节数。研究者比较了水蛭素治疗的 TRAMP 小鼠和 PBS 处理的小鼠，使用 ki-67 染色法监测细胞增值情况，显示水蛭素抑制 TRAMP 小鼠 （C57BL/6 and C57BL/6FVB）的前列腺癌的生长，肿瘤体积、肿瘤百分比和前列腺肿瘤的重量都分别下降，前列腺癌的发生率也降低，证明水蛭素对肿瘤浸润有良好的拮抗作用，对肿瘤有丝分裂也有抑制作用。研究发现，水蛭素能减少肺癌病人支气管肺泡灌洗液诱导的 MCF-7、A-431、Sk-Mel-28 等肿瘤细胞的增值；使用水蛭素治疗，最初治疗组小鼠肺部肿瘤数量与对照组是一样的，但肿瘤细胞的扩散及随后的驻留在抗凝小鼠肺部明显被抑制。因此，水蛭素预处理后肿瘤细胞的生长和增值被抑制，已经形成的肿瘤使用水蛭素后也能被抑制。

6. 疗纤维沉淀性关节炎　

关节纤维蛋白积累可导致胶原诱导的关节炎， PEG-水蛭素能有效减少CIA的病情严重性和发生率。组织学分析表明PEG-水蛭素能有效地减少滑液增生，减少关节纤维蛋白沉积，对关节炎既有预防又有治疗效果。

7. 减轻脑出血水肿　

利用大鼠自体新鲜无肝素未凝动脉血定量脑出血模型，观察不同时间大鼠脑出血周围脑组织含水量，离子含量变化，研究水蛭素对水肿程度及离子含量的影响，结果表明大鼠脑出血后早期脑组织含水量，离子含量随时间推移而升高、变化，而水蛭素可减轻其水肿程度及离子变化。

8. 抑制增生性玻璃体视网膜病变　

将水蛭素0.1mL(10单位)注入兔玻璃体腔内，对照组注入0.1 mL生理盐水，用放射免疫法测定玻璃体腔内层粘连蛋白和IV型胶原的含量，结果表明外伤后一周水蛭素组比对照组含量明显下降，水蛭素对外伤性增生性玻璃体视网膜病变有一定的抑制作用。

10. 治冠状动脉成形术后再狭窄　

水蛭素在防治冠状动脉成形术(PTCA)后再狭窄的发生有明显的效果。应用重组水蛭素对113例因不稳定心绞痛(USA)作PTCA患者进行观察。水蛭素剂量首次20 mg,以后为每小时0.16 mg /kg维持24 h；并与常规剂量的肝素组作对照。结果显示，术中及术后心肌梗塞发生率，水蛭素组为1.4% ,肝素组为10.3% ；24 h血管完全再通率，水蛭素组为100%，肝素组为91%。且出血不良反应水蛭素组仅为3.5%。

此外，水蛭素在防治不稳定性心绞痛、急性心肌梗塞，血液透析等方面都有很好的效果。

【提取】

双水相-反胶束提取法提取水蛭素：

1）将菲牛蛭鲜活个体放入80～90℃的热水中2～3分钟，迅速捞出，放冷至室温，沥至半干；或将于-18℃保存的菲牛蛭个体取出，放至室温，沥至半干。

2）取一定量将沥至半干的菲牛蛭个体于组织捣碎机中以10000～12000r/min处理5～6分钟捣成浆状。

3）取一定量浆状物按重量加入2～2.5倍的生理盐水240～300r/min搅拌2.5～3小时。

4）4000～4500r/min离心10分钟取水相，备用，沉淀用组织捣碎机10000～12000r/min处理2～3分钟捣成浆状。

5）按步骤3)浆状物的重量加入1.5～2倍生理盐水240～300r/min搅拌2～2.5小时。

6）4000～4500r/min离心10分钟取水相，备用，沉淀用组织捣碎机10000～12000r/min处理2～3分钟捣成浆状。

7）按步骤3)浆状物的重量加入1～1.5倍生理盐水240～300r/min搅拌2～2.5小时，4000～4500r/min离心10分钟去沉淀，取水相备用。

8）合并3次的水相，加入硫酸钠使浓度为0.05mol·L-1，加聚乙二醇6000使质量浓度为30％，240～300r/min搅拌30分钟。

9）4000～4500r/min离心20分钟，分离上、下相。

10）取上相水溶液加入2.8～3倍无水乙醇搅拌均匀，冷藏过夜，4000～4500r/min离心10分钟取沉淀。

11）沉淀溶解于4倍重量的生理盐水中，用0.05mol·L-1的HCl溶液调至pH1.8，得酸性水蛭素溶液。

12）正辛烷加入丁二酸-2-乙基己基酯磺酸钠使浓度达到0.06mol·L-1，240～300r/min搅拌30分钟，得反胶束提取液。

13）酸性水蛭素溶液加入2倍体积反胶束提取液，240～300r/min搅拌30分钟。

14）4000～4500r/min离心30分钟，取上相。

15）上相溶液加入1.5～2倍体积pH9.4的生理盐水，240～300r/min搅拌30分钟。

16）4000～4500r/min离心30分钟取下相，加2.8～3倍无水乙醇混合均匀，冷藏过夜。

17）4000～4500r/min离心30分钟取沉淀得水蛭素。

【主要参考资料】

[1] 张和韡, 王丽萍. 水蛭素的研究进展[J]. 中国中西医结合肾病杂志, 2013, 14(1): 76-78.

[2] 毛全高. 水蛭素剂型研究进展[J]. 安徽医药, 2015, 19(12): 2250-2254.

[3] 严令耕, 黄臣虎, 陆茵, 等. 水蛭素抗凝血和抗肿瘤转移的研究进展[J]. 中药新药与临床药理, 2010, 21(6): 667-670.

[4] 赵恒利, 崔晞, 郭瑞臣. 水蛭素基础及临床研究发展状况[J]. 中国药学杂志, 2006, 41(5): 321-324.

[5] 陈华友, 黄静, 蒋芝君, 等. 抗凝良药水蛭素的研究进展[J]. 生物学通报, 2003, 38(3): 3-5.

[6] 苗艳丽;宋文东;王宏波;方富永. 一种水蛭素的双水相-反胶束提取法. 

CN101759802，申请日2009-11-27.