寡核苷酸药物成药性改造面临的挑战

背景及概述^[1]

寡核苷酸药物 (oligonucleotides, ONs) 是由人工化学合成的 12～30 个核糖寡核苷酸单链或双链组成的一类药物, 通过 Watson-Crick 碱基配对原则作用于目标信使 RNA (mRNA) 主要分为反义寡核苷酸药物 (antisense oligonucleotides, ASOs) 和小干扰RNA药物 (small interference RNA, siRNA) 两大类。

虽然人工合成寡核苷酸调节靶向基因表达的概念在 40 年前就被提出, 但是因为核酸的药动学成药性差、脱靶毒性、递药系统等技术瓶颈没有解决, 主要用于细胞或动物科研实验中的基因敲除。随着过去20年化学和生物技术的发展, 一些关键技术难题被攻克,全球迎来核酸类药物研发热潮。2016至 2019短短 3年间, 美国 FDA 就批准了 4个反义寡核苷酸类药物 (Defibrotide、Eteplirsen、Nusinersenand和 Inotersen) 和 2个 siRNA 药物 (Patisiran、Gi‐vosiran), 其调节转录翻译的机制引起制药行业关注。一些罕见、疑难疾病, 如遗传性转甲状腺素蛋白淀粉样变性、杜氏肌萎缩症、乙型肝炎等仍然不能得到有效治愈, 核酸类药物通过基因敲除或者剪接调控机制有望填补小分子药物和单克隆抗体药物的空白治疗领域。目前全球有50多个寡核苷酸药物处于不同的临床研究阶段, 覆盖罕见病、难治愈疾病多个治疗领域。中国寡核苷酸药物的研发公司多处于起步阶段,主要集中在昆山小核酸产业基地。

成药性改造面临的挑战^[1]

1 化学修饰

未经化学修饰的寡核苷酸药物成药性通常不理想。它们具有较差的 PK 特性, 比如稳定性差, 易被核酸酶降解; 极性大, 很难进入细胞, 分布特性差; 对目标 mRNA的结合亲和力不佳。为了达到临床效用, 寡核苷酸必须经过化学改造 (图 1)。

目前广为使用的结构改造的基础骨架是磷硫 (PS) 修饰, 即将非桥接的磷酸二酯氧替换成硫原子。PS 骨架的修饰减少了寡核苷酸的亲水性、增加了对核酸酶降解的抵抗力以及增加了其与血浆蛋白结合 进而使得寡核酸稳定性增加, 减少肾小球滤过到尿液中排泄。PS骨架的改造虽然改善了部分PK特性, 使其系统暴露增加进而增加细胞摄取和转运, 但是单一的PS骨架修饰不能保障寡核苷酸不被酶降解, 并且在高浓度时这种修饰降低了寡核苷酸和靶标的亲和力, 使机体产生炎症反应。为了进一步增加靶标结合亲和力、抵抗核酸酶降解、减少促炎症反应, 在20世纪90年代出现了具有糖基修饰的二代寡核苷酸药物二代寡核苷酸是在 PS 骨架修饰的基础上将2′-羟基 (2′-hydroxyl, 2′-OH) 替换成2′-甲氧基 (2′-O-methyl, 2′-O-Me)、2′-甲氧乙氧基 (2′-Omethoxyethyl, 2′-MOE)、2′-氟 (2′-fluoro, 2′-F) 或者引入构象约束结构, 比如锁核酸 (locked nucleic acid, LNA)以及它的甲基化衍生物即约束乙基 (constrained ethyl,cEt)。2′-F或者2′-O-Me 20世纪60年代就合成了, 但是30年后才应用到临床治疗中。2′-O-Me的修饰提高了靶标亲和力、核酸酶降解的抵抗力以及减弱 PS 骨架引起的免疫刺激性，在 2′-O-Me 基础上, 2′-MOE可以进一步增加靶标结合亲和力和抵抗核酸酶降解。而相对于 2′-MOE, LNA、cEt 结构降低了构象灵活性,与靶标亲和性增加了5～10倍然而LNA和cEt报道和肝毒性有关, 这种肝毒性可能由脱靶降解不匹配的RNA造成。目前仍在探索其他的结构化学改造方式, 2′-MOE在反义寡核苷酸药物中应用最多。上市的Mipomersen、Nusinersen 和 Inotersen 均是这种化学修饰, 同时还有 20 多个同类药处于临床不同研究阶段。但是对于 siRNA 而言, 2′-MOE 改造应用有限, siRNA广泛应用 2′-F 或者 2′-O-Me, 如上市的 Patisiran, 同时应用了2′-F和2′-O-Me修饰。

2 细胞内递送

单克隆抗体药物通常和细胞外的可溶性靶标或者细胞表面的靶标结合发挥治疗作用, 而寡核苷酸药物必须进入细胞才能产生药理活性。和小分子相比, 寡核苷酸药物的分子质量较大 (6～14 kDa), 高度带负电,亲水性高, 不易透过脂质双分子层和血脑屏障。没有递送系统的ASOs (～7 kDa), 大多数通过网格蛋白或者小窝蛋白介导的胞饮作用摄取进细胞。寡核苷酸的细胞内化分为“有效途径”和“无效途径”“有效途径”有依赖于非巨胞饮作用和内含体的细胞内分布, 寡核苷酸从内含体逃逸出来, 进入细胞质或细胞核内发挥药理作用, 而“无效途径”也就是巨胞饮途径, 导致寡核苷酸聚集在溶酶体中被降解或清除出细胞。在内含体中有很多和先天免疫相关的Toll样受体 (Toll like receptors, TLRs), 当TLRs识别进入内含体的 ONs可能会引起干扰素和其他细胞因子的激活。这个问题在代核酸类药物中比较常见, 第二代核酸经过核糖骨架的 2′-O-甲基等修饰很大程度上解决了这个问题。

和分子质量～7kDa的ASOs相比, 分子质量～14 kDa的双链siRNA因为较大分子体积和亲水性, 经细胞摄取有限。为了增加细胞摄取, siRNA通常连接靶向配体, 比如N-乙酰半乳糖胺 (N-acetylgalactosamine, GalNAc)包裹在脂质纳米粒中。

参考文献

[1]汤仙阁,关晓多,陈锐,胡蓓.寡核苷酸药物的临床药理学研究进展[J].药学学报,2020,55(02):218-225.