OP9小鼠骨髓基质细胞的应用

背景^[1-3]

OP9小鼠骨髓基质细胞源自新生的op/op小鼠颅盖。因编码M-CSF的基因中的一个突变，OP9细胞不能生成有功能的巨噬细胞克隆刺激因子(M-CSF)。M-CSF的存在对胚胎干细胞(ES)分化成血细胞而不是其他巨噬细胞有抑制功能。OP9细胞可以用于与小鼠胚胎干细胞共培养以诱导胚胎干细胞分化成成红血球来源的、骨髓来源的和B细胞谱系的血细胞。与OP9细胞共培养不需要外源的生长因子或复杂的胚胎结构，这个系统对研究造血细胞的发育和分化的分子机理有用。

OP9小鼠骨髓基质细胞

细胞接收后的处理

1）收到细胞后，75%酒精消毒瓶壁将T25瓶置于37℃培养箱放置约2-3h。

2）请在4或5X显微镜下确认细胞状态，同时给刚收到的细胞拍照（10×，20×）各2-3张以及培养瓶外观照片一张留存，作为售后时收到时细胞状态的依据。

3）贴壁细胞：细胞在37℃培养箱中放置2-3h，显微镜下观察细胞的生长和贴壁情况，有些贴壁细胞在快递运送过程中会因振动脱落和脱落后成团的情况。

若镜下观察细胞的生长密度若在60%以下，可去除培养瓶中灌液培养基（若有未贴壁的细胞需要离心回收，重悬打入到原培养瓶中）,加入新配制的完全培养基6-8mL，放到细胞培养箱中继续培养。

若细胞生长密度达70%-80%以上，可以对细胞进行传代处理。传代过程中，若因运输振动脱落的细胞需要离心回收。

应用^[4][5]

用于与OP9细胞共培养诱导人ES细胞向造血分化体系的研究

通过探究OP9细胞的接种密度,以达到缩短诱导分化周期的目的,优化体外造血分化体系。通过体外诱导造血分化的技术,建立人胚胎干细胞体外诱导造血分化的平台,为干细胞治疗奠定基础,也为研究造血细胞的发生生育的调控机制提供了依据。

探索OP9共培养诱导造血分化的条件,为体外诱导分化及机制研究建立平台。

方法:传统的与小鼠骨髓间充质细胞OP9细胞共培养诱导造血分化,OP9细胞前期培养以及诱导分化过程的周期约为2-3周,利用本实验室已建系的人胚胎干细胞株HN14,将OP9细胞设置成实验组和对照组,实验组:OP9细胞密度设置6个梯度即1.5,2.5,3.5,5.0,6.5,8.0×105/ml接种至10cm皿培养24h后,即与HN14共培养诱导造血分化;

对照组:应用传统方法,将OP9细胞按1.5×105/ml接种培养4天后,达到融合状态后进行共培养。通过观察形态变化、流式检测、实时荧光定量PCR及集落形成实验比较造血分化的效率。

结果:无论是实验组还是对照组,镜下观察,ES细胞均出现不同程度地分化。采用流式细胞术检测共培养过程中第8、10、12天的CD34细胞阳性率,对照组在第12天达高峰,CD34的阳性率达10%左右,相较而言,在实验组中,CD34的阳性率提前2天达高峰,即在共培养第10天达高峰,且分化效率与对照组无差异（P值>0.05）。

实时荧光定量PCR结果显示,中胚层的标志性基因BRACHYURY,呈现先升高后下降的趋势,在对照组在第6天达高峰,而实验组在第4天表达达高峰,这与CD34的表达高峰出现时间相一致。

参考文献

[1]Forced aggregation of defined numbers of human embryonic stem cells into embryoid bodies fosters robust,reproducible hematopoietic differentiation.Ng Elizabeth S,Davis Richard P,Azzola Lisa,Stanley Edouard G,Elefanty Andrew G.Blood.2005

[2]Lentiviral Vector Design and Imaging Approaches to Visualize the Early Stages of Cellular Reprogramming.Eva Warlich,Johannes Kuehle,Tobias Cantz,Martijn H Brugman,Tobias Maetzig,Melanie Galla,Adam A Filipczyk,Stephan Halle,Hannes Klump,Hans R Schler,Christopher Baum,Timm Schroeder,Axel Schambach.Molecular Therapy.2011

[3]Induction of pluripotent stem cells from adult somatic cells by protein-based reprogramming without genetic manipulation.HJ Cho,CS Lee,YW Kwon,JS Paek,SH Lee,J Hur,EJ Lee,TY Roh,IS Chu,SH Leem,Y Kim,HJ Kang,YB Park,HS Kim.Blood.2010

[4]Primitive human hematopoietic cells are enriched in cord blood compared with adult bone marrow or mobilized peripheral blood as measured by the quantitative in vivo SCID-repopulating cell assay.Wang J C,Doedens M,Dick J E.Blood.1997

[5]江欣星.与OP9细胞共培养诱导人ES细胞向造血分化体系的研究[D].郑州大学,2016.