NADPH的分离纯化方法和制备方法

背景及概述^[1]

NADPH即还原型辅酶，学名：还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(triphosphopyridine nucleotide)，是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)中与腺嘌呤相连的核糖环系2'-位的磷酸化衍生物，在很多生物体内的化学反应中起递氢体的作用，并且参与多种代谢反应的合成，如脂类、脂肪酸和核苷酸的合成，还可以在暗反应中为二氧化碳的固定进行供能。在上述反应中， NADPH是NADP+的还原形式，NADPH的作用是还原剂和氢负离子的供体；同时，NADPH是细胞内抗氧化防御系统的重要组成成分，在细胞防御活性氧(ROS)损伤方面起着重要的作用。

有文献报道，细胞的生长、分裂、分化、迁移、凋亡及衰老等许多生命活动，也与NADPH密切相关；而且，维持NADPH(NADH)的固定浓度，或者外加辅助的NADPH(NADH)，可以对抗细胞的凋亡和衰老过程，延缓机体衰老。最新的研究发现，NADPH和NADH在机体生理与病理条件下都发挥重要的功能。当前，对细胞内NADPH(NADH)作用和代谢的研究已成为国际性的研究热点。

分离纯化方法^[1]

NADPH的分离纯化方法，包括以下步骤：

将NADPH粗品溶液采用0.45μm微孔滤膜进行过滤，得供试品溶液；将所述供试品溶液通过反相柱层析纯化，反相柱层析的介质为C18，颗粒度为 10μm，粒径为色谱柱为Sepax GP-C18，以10mM NaH2PO4缓冲液为流动相A，以体积分数为100％的甲醇为流动相B，先用体积分数为100％的甲醇进行活化洗脱30min，再用A：B的体积比为95％：5％的流动相进行平衡洗脱 35min，然后按照如下程序进行梯度洗脱：0-10min，A：B的体积比为95％：5％；10-40min，A：B的体积比为90％：10％；40-60min，A：B的体积比由90％：10％→40％：60％；60min，A：B的体积比为60％：40％，柱温为 15℃，流速为40mL/min，检测波长为260nm，HPLC检测，收集，浓缩，干燥，即得。

本实施例整个分离纯化过程仅需3小时即可完成，收率为55％。

制备方法^[2]

一种固定化酶催化制备NADPH的工艺，包括如下步骤：

1)用磷酸氢二钾和磷酸二氢钾分别配置0.1mol/L和0.2mol/L的磷酸缓冲溶液(pH 6.8－7.2)，备用。

2)配置1.25mol/L的氢氧化钠溶液，备用。

3)将130g硅胶加入到300mL、0.2mol/L的磷酸缓冲溶液中浸泡12h；浸泡后，清洗硅 胶：去除上清液，将130g浸泡后的硅胶加入300mL、0.2mol/L的新鲜磷酸缓冲溶液，震荡 3min，静置2min，更换缓冲液，清洗硅胶的步骤重复4次。

4)将处理好的硅胶置于73g GDH溶液(14.6g GDH用0.1mol/L磷酸缓冲溶液稀释5 倍，GDH的比活力为600u/mg)中，并在25℃下吸附固定55min，得到固定化GDH。

GDH的固载率测定：采用考马斯亮蓝法，测出固定前游离酶含量、固定后上清液游 离酶含量，测出GDH的固载率为60％。

5)取200g葡萄糖和10g氧化型NADP+，用0.1mol/L磷酸缓冲溶液定容至1000mL，备 用。

6)取一烧杯向其中加入580mL上述混合溶液和步骤4中固定的GDH，于37℃下保温 搅拌反应，并滴加氢氧化钠溶液维持pH＝7.0。

7)实验表明，当反应时间为15min时，NADPH-Na4生成量为4.008g，15min后，NADPH- Na4的合成速率显著下降。

参考文献

[1] [中国发明,中国发明授权] CN201611089629.3 一种NADPH的分离纯化方法

[2] [中国发明] CN201810430317.7 一种硅胶固定GDH催化制备NADPH的方法