一氧化氮（NO）的检测方法与注意事项

一氧化氮NO (即血管内皮舒张因子)，在生物体内作为一种反应性极强的自由基，兼有第二信使和神经递质作用，同时又是一种效应分子，在体内具有广泛的生理作用，如松弛血管平滑肌，抑制血小板聚集，调节脑血流，介导细胞毒效应和免疫调节，参与学习和记忆、动脉粥样硬化等作用。NO 产生异常与某些疾病的发生发展有着密切关系。因此，近年来对NO的研究越来越受到广大医学科学工作者的重视。

NO化学性质活泼，体内代谢转化为硝酸盐（NO3¯）和亚硝酸盐（NO2¯），血清(NO3¯)与(NO2¯)浓度之和（NO3¯＋NO2¯）才能准确代表体内(NO)水平。血清（NO3¯＋NO2¯）含量测定，国内有的单位采用金属镉还原法，但该法操作繁琐（血清需除蛋白），反应不易控制（金属镉可将NO2¯进一步还原），且不能完全将NO3¯还原为 NO2¯，准确性差。目前常用的试剂盒有以下两种。

一、（酶法）比色法

（一氧化氮（NO）测定试剂盒 图片来自网络）

01.检测范围：

血清（浆）、红细胞、动物组织样本、培养的细胞、细菌、植物组织。

02.测试原理：

NO化学性质活泼，在体内代谢很快转为NO:和NO,而NO又进一步转化为NO.本法利用硝酸还原酶特异性将NO还原为NO2,通过显色深没测定其浓度的高低。

03.测试所需的仪器设备

a）分光光度计/酶标仪/半自动生化分析仪（比色测定波长为550nm）

b）恒温水浴箱或气浴箱 （孵育温度为37℃）

c）漩涡混匀器

d）台式离心机

e）微量移液器

（微量移液器 图片来自网络）

04.样本收集与前处理：

a）血清（浆）可直接测定。

b）红细胞：需按照试剂盒中说明书上红细胞的测定方法进行提取后测定。

c）动物组织样本：可用生理盐水按重量体积比制备成组织匀浆液，离心取上清测定。

（组织匀浆 图片来自网络）

d）培养细胞、细菌、植物组织：常用PBS作为匀浆介质破碎后离心取上清测定。

e）具体的样本前处理：一般参考各公司的详细说明书。

05.注意事项

a）冬天测试时，所有的试剂均应于37℃预热5分钟。

b）取上清时，如果上清不够，请延长离心时间，或者少取一点。例如:可取0.4或0.45ml,但同一批实验所有的管子都应取上清的 要一致，千万不可将沉淀吸上。

c）因组织中NO含量较少，组织匀浆般为 10%或20%，且做好的组织匀浆离心速度为 2500转/分，离心10分钟，转速不可过高，时间不可太长，样本取样量较大，以0.3~0.5ml 左右为宜。

d）试剂盒中试剂一般避免反复冻融，如果需要分批实验(3次以上)，可以在次实验时将试剂分装后再保存，根据每次实验时的试剂用量取出待用。配好的显 色剂避光保存。

e）血清(浆)、组织等标本如不马上检测，应放于-70℃以下保存，半年内有效。

f）所有配试剂的双蒸水和空白管中加的双蒸水均要用不含NO2的双蒸水或三蒸水。(试剂盒中一般配有双蒸水)

g）在样本与底物反应完毕后，离心，取上清时千万不可将沉淀吸出，否则吸光度会增高很多，明显影响结果的真实性。

①、用一次性塑料试管或干净的离心管:

②、若用玻璃管,清洗如下:先用洗涤剂泡半个小时以上，煮0.5-1个小时，洗刷后，用自来水冲洗15-20遍，甩干，双蒸水冲洗1-2遍，烘干。

06.优点

a）冬天测试时，快速简便：全程约2小时。

b）稳定性好：试剂盒2～8℃存放3个月有效。

c）再现性好：变异系数CV=1.7%。

d）回收试验：X =103.3%。

e）受外界影响因素小：干扰因素少，重复性强。

f）测试面广：可测动物血液、组织、细胞、各种培养细胞、脑脊液、胸水、腹水、尿液、胃液、植物组织以及各种水产效果均佳。

二、微板法

（一氧化氮（NO）测定试剂盒 图片来自网络）

01.检测范围

可测动物血液、组织、细胞、各种培养细胞、脑脊液、胸水、腹水、尿液、胃液、植物组织以及各种水产。

02.样本收集与处理

a）血清（浆）可直接测定。

b）红细胞：一般需按照所购试剂盒中说明书上红细胞的测定方法进行提取后测定。

c）a动物组织样本：可用生理盐水按重量体积比制备成组织匀浆液，离心取上清测定。

d）培养细胞、细菌、植物组织：常用PBS作为匀浆介质破碎后离心取上清测定。

03.所需仪器及自备试剂

a）分光光度计/酶标仪/半自动生化分析仪（比色测定波长为550nm）

b）恒温水浴箱或气浴箱（孵育温度为37℃）

c）漩涡混匀器

d）台式离心机

e）微量移液器

04.优点

a）快速简便：全程约2小时，可测100例以上样本。

b）稳定性好：试剂盒2～8℃存放6个月有效。

c）再现性好：变异系数CV=1.7%。

d）回收试验：X =101%。

e）受外界影响因素小：干扰因素少，重复性强。

f）测试面广。