L929细胞的应用

背景^[1-3]

L929细胞是小鼠上皮样成纤维细胞呈贴壁生长。是在1948年3月建立了NCTC clone 929(小鼠结缔组织)，细胞系L的克隆。细胞系L是最早建立的连续培养细胞系之一，而clone 929是最早的克隆株。从一只100日龄的雄性C3H/An小鼠的皮下网眼状空隙和脂肪组织中建立了亲本细胞系L。第95代的细胞系L使用毛细管法分离单细胞建立了clone929。检测发现鼠痘病毒阴性。

L929细胞

L929(小鼠成纤维细胞)常规培养传代流程（请严格遵守无菌操作）

1.吸出原培养瓶中的培养基，PBS缓冲液润洗细胞两次，加1~2 ml 0.25%EDTA的胰酶消化（注意把握消化时间，通常控制在1~2min）。

2.镜下观察消化情况，在细胞边缘缩小，贴壁运动时（不建议消化到细胞漂浮）去掉胰酶，加6~8ml完全培养基，轻轻吹打细胞层，尽量把细胞层吹落、吹散。

3.取出部分细胞悬液转移到新的培养皿/瓶中，添加适当的完全培养基，于培养箱中培养。

4.注意培养基PH值变化情况，定期换液，待细胞密度达到70-80%时重复传代操作或者冻存。

应用^[4][5]

用于不同浓度D-缬氨酸对小鼠成纤维细胞L929增殖和凋亡的影响研究

前期实验已证实特定浓度（50-150mM）下的D-缬氨酸（D-valine,D-val）能有效抑制牙龈卟啉单胞菌生物膜的形成,有望将其应用于控制生物膜感染的治疗。

因此,明确其生物安全性并筛选出安全浓度范围的D-缬氨酸,为其可能作为抑制生物膜形成或/和分散已形成的生物膜的制剂,治疗种植体周围炎具有重要意义。

方法:1、培养小鼠成纤维L929细胞,组织学观察细胞形态及生长状态,绘制生长曲线。

2、实验组分别加入不同浓度的D-val,对照组加入等体积的DMEM培养液。分别在第1、3、5天采用CCK-8法检测不同浓度的D-val对成纤维细胞L929增殖活性的影响。

3、实验分组同上,于加入D-val 5天后收集细胞,Annexin V FITC/PI双染后用流式细胞术检测细胞凋亡状况。

4、实验分组同上,用Quantitative Real-time PCR技术检测各组细胞凋亡相关基因Bax、Bcl-2和Caspase-3的相对表达量。

5、采用SPSS17.0统计软件包进行统计学分析,数据以均数±标准差表示,采用单因素方差分析。

结果:1、CCK-8法检测结果显示,在第1,3,5天三个时间点,实验组的细胞吸光度值均低于未加入D-val组。实验组细胞的增殖活性下降,且下降的趋势呈浓度依赖性,即随着D-val浓度的增大,细胞增殖活性下降越明显。当D-val浓度在100-150mM时,细胞的增殖活性受到明显的抑制,且结果具有统计学差异（P<0.05）。

2、加入D-val培养5天后,流式细胞仪检测各组中L929细胞的凋亡率,实验组的细胞凋亡率均值皆低于正常组细胞。

参考文献

[1]A retrospective study on 1592 consecutively performed operations in one private referral clinic.Part II:Peri‐implantitis and implant failures[J].Torsten Jemt DDS,PhD,Michel Karouni DDS,Jérémy Abitbol DDS,Ons Zouiten DDS,Hadi Antoun DDS.Clinical Implant Dentistry and Related Research.2017(3)

[2]An Up to 12‐Year Retrospective Follow‐Up on Immediately Loaded,Surface‐Modified Implants in the Edentulous Mandible[J].Stefan Vandeweghe DDS,PhD,Peter Hawker DDS,MSc,Hugo De Bruyn DDS,MSc,PhD.Clinical Implant Dentistry and Related Research.2016(2)

[3]Molecular mechanisms of antimicrobial tolerance and resistance in bacterial and fungal biofilms[J].Heleen Van Acker,Patrick Van Dijck,Tom Coenye.Trends in Microbiology.2014

[4]Mitochondria in Apoptosis:Bcl-2 Family Members and Mitochondrial Dynamics[J].Jean-Claude Martinou,Richard J.Youle.Developmental Cell.2011(1)

[5]崔云霞.不同浓度D-缬氨酸对小鼠成纤维细胞L929增殖和凋亡的影响[D].吉林大学,2019.