慢病毒浓缩试剂盒的应用

背景^[1-3]

慢病毒浓缩试剂盒对所有类型的慢病毒颗粒进行简单快速的浓缩。该试剂盒操作简单，仅需将5×浓缩液与慢病毒上清按比例混合并孵育一段时间，正常转速离心，即可得到浓缩的慢病毒颗粒，回收率高达90%以上，可提高100倍病毒滴度。

慢病毒显微示意图

操作步骤

1.病毒包装成功后，收集慢病毒上清液，0.45μm滤膜过滤，去除细胞和碎片。

滤膜过滤需使用低蛋白吸附的纤维素醋酸酯或聚醚砜（PES）膜。切忌用硝酸纤维素膜（NC）。

2.将慢病毒上清液与试剂盒中的浓缩液按照体积比4:1的体积混合（上清液4份，浓缩液1份），4℃孵育2h或过夜。刚开始时每隔30min混匀一下，混匀进行3次。

延长孵育时间可以提高回收率。慢病毒颗粒在4℃可以稳定保存数天。

3.于4℃，4000g离心25min。

4.小心去除上清，不要剧烈晃动管子，一般可见白色沉淀（有时沉淀不可见）。

5.用初始体积（原上清液体积）1/10-1/100的DMEM或PBS重悬病毒颗粒，小心吹打均匀，重悬沉淀物。

6.重悬后的病毒以50µl/管分装，于-80℃冰箱保存。

慢病毒冻存液避免反复冻融，否则会降低病毒滴度。

应用^[4][5]

用于人Bmi-1基因shRNA慢病毒表达载体的构建、病毒的浓缩及其病毒滴度的测定研究

构建人Bmi-1基因的慢病毒载体,通过转染293T细胞收集病毒液,浓缩病毒液并对该病毒液进行滴度的测定。

方法:设计以Bmi-1基因为靶点的短发夹状RNA（sh RNA）,将3条Bmi-1基因的sh RNA片段插入至慢病毒载体,对其进行筛选及鉴定。转染具有高转移性的293T细胞,收集病毒液并对病毒液进行浓缩,利用荧光滴度法检测病毒的滴度。

结果:构建含有Bmi-1-sh RNA的重组慢病毒载体,经转化大肠杆菌DH5α后提取质粒,与空载体均经Eco RI和Bam HI双酶切后,琼脂糖凝胶电泳鉴定。测序结果证实重组的RNA干扰慢病毒载体均有一段与实验设计合成的靶向链相符。测序结果显示重组构建成功。

将筛选出的重组慢病毒载体PLVX-sh RNA2-Bmi-1与包装质粒PLP1、PLP2和PLP/VSVG共转染293T细胞,同时设立空载体为对照组。收集的病毒浓缩液经稀释后感染293T细胞,利用荧光滴度法成功检测出病毒滴度。

结论:成功构建了Bmi-1基因的sh RNA慢病毒表达载体,通过转染293T细胞后获得了该基因的病毒液并对病毒液进行浓缩,包装成慢病毒颗粒,通过感染目的细胞后用荧光法成功测定出该病毒液的滴度,为探讨下一步Bmi-1基因对鼻咽癌细胞的功能影响奠定了基础。

参考文献

[1]IARC Scientific Publications No.155.Parkin MD,Whelan SL,Ferlay J,et al.Lyon France.2002

[2]Phase III study comparing standard radiotherapy with or without weekly oxaliplatin in treatment of locoregionally advanced nasopharyngeal carcinoma:preliminary results.Zhang L,Zhao C,Peng PJ,et al.Journal of Clinical Oncology.2005

[3]Emerging molecular targeted therapies in the treatment of head and neck cancer.Alexandre Bozec,Frédéric Peyrade,Jean-Louis Fischel,Gérard Milano.Expert Opinion on Emerging Drugs.2009

[4]The Bmi-1 oncogene induces telomerase activity and immortalizes human mammary epithelial cells.Dimri G P,Martinez J L,Jacobs J J,et al.Mutation Research.2005

[5]罗逸.人Bmi-1基因shRNA慢病毒表达载体的构建、病毒的浓缩及其病毒滴度的测定[D].遵义医学院,2015.