依替巴肽的作用机制是什么

【概述】

依替巴肽（Eptifibatide），化学名为N6-氨基亚氨基甲基-N2-（3-巯基-1-氧丙基）-L-赖氨酰甘氨酰-L-α-天冬氨酰基-L-色氨酰-L-脯氨酰基-L-半胱氨酰胺，环-（1→6）-二硫化物，一合成环肽，是继阿昔单抗(Abciximab)及替罗非班(Tirofiban)之后又一个第三代新型抗血小板药物，是由美国CORTherapeutics（COR治疗）公司和美国Schering-Plough（先灵葆雅）公司共同研制开发的抗血小板聚集剂。其主要用于急性冠动脉综合症（ACS），防止心肌供养动脉闭塞，心脏病发作，冠脉介入治疗引起的猝死等。其活性基团主要为赖氨酸-甘氨酸-天冬氨酸，与血小板糖蛋白Ⅱb／Ⅲa受体具有较高亲和力，是一种新型的血小板糖蛋白GPⅡb／Ⅲa受体拮抗剂。

图1为依替巴肽

【作用机制】

血管内皮的完整和血管内皮功能的正常是保持血管壁平滑和血流通畅的重要条件。当血管壁上动脉粥样硬化斑块破裂时,会使内皮下胶原组织暴露,血小板通过其细胞膜糖蛋白上的Ⅰb和Ⅱa/留受体和胶原组织相结合,引起血小板黏附。血小板黏附后,在一些刺激因素作用下可进一步使血小板激活。血小板激活后,导致血小板变形和释放。血小板变形使血小板糖蛋白上原来隐藏的受体暴露,可与凝血因子Ⅰ结合,从而导致血小板聚集。因此,从作用机制上阿司匹林、噻氯匹定、氯毗格雷、水蛭素等只能抑制某一种因子所诱导的血小板激活,抗血小板聚集作用较弱。而血小板糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受体拮抗剂抑制了血小板聚集的最后共同途径,抗血小板聚集作用强。

GP Ⅱb/Ⅲa受体是整合素家族中的一员,它有两个结合点,一个RGD识另序列,另一个识别KGD序列。依替巴肤与GP Ⅱb/Ⅲa受体的亲和力比凝血因子Ⅰ强,依替巴肤分子中修饰了的KGD序列可与血小板糖蛋白上Ⅱb/Ⅲa受体特异性结合,“封闭”了Ⅱb/Ⅲa受体,使凝血因子Ⅰ不能与血小板糖蛋白上Ⅱb/Ⅲa受体相结合。由于1个凝血因子Ⅰ可与2个GP Ⅱb/Ⅲa受体相结合(1个血小板上有多个Ⅱb/Ⅲa受体,可与多个凝血因子Ⅰ相结合),凝血因子Ⅰ与GP Ⅱb/Ⅲa受体相结合的结果是引起血小板的“桥联”,引起血小板聚集。而1个依替巴肤分子只能与1个Ⅱb/Ⅲa受体相结合,依替巴肤与GP Ⅱb/Ⅲa受体相结合的结果是“封闭”了Ⅱb/Ⅲa受体发挥抗血小板聚集作用。

【药效学和药动学】

由于依替巴肽结构式中的KGD序列，使其对GPIIb/IIIa具有高度的亲和性，所以在血液中有低浓度依替巴肽存在时就可以迅速的抑制血小板聚集。依替巴肽抗血小板作用是可逆的。临床上停止用药后，依替巴肽可以迅速与GPIIb/IIIa解离，并可以快速从血中清除，这样血小板就可以迅速的恢复正常止血功能。由于分子量较小，依替巴肽没有免疫原性及抗体反应，所以对于需要重复给予GPIIb/IIIa抑制剂或病史不明的病人来说，给予依替巴肽治疗是选择。由于依替巴肽的环状结构，可以使其避免被蛋白酶破坏，从而增加其生物利用度。血小板GPIIb/IIIa抑制剂是抑制血小板聚集的最终共同途径，所以被认为是最有效、合理的抗凝血药物。这些特性使依替巴肽在临床应用上较阿昔单抗等其他抗血小板药物更有优势。临床上也越来越多的应用依替巴肽来治疗急性冠脉综合症(ACS)及辅助冠状动脉介入治疗(PCI)。

在临床试验结果显示，受试者血浆中依替巴肽的浓度与静脉滴注给药的剂量及速率(0.2-1.5μg/kg/min)是成正比的，半衰期为50-60min。I期临床研究表明，63名健康受试者在接受恒速(1.0-1.5μg/kg/min)滴注依替巴肽后，血小板聚集可被完全抑制，并且可在停止滴注后2-4小时内逆转抗凝效应。临床上没有出现过出血事件。依替巴肽半衰期短，能够在体内经肾或肾外途径进行快速清除，清除速率与患者体重成正比，与年龄成反比。

【制备方法】

1.固相/固液相结合合成依替巴肽

（1）以RinkAmideAM树脂或Sieber树脂为固相载体，经20%哌啶／DMF溶液（DBLK）脱Fmoc保护制得NH2-RinkAmideAM树脂或NH2-Sieber树脂（2），2采用Fmoc固相合成法，以1-羟基苯并三唑（HOBt）、N，N-二异丙基碳二亚胺（DIC）或O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐（HBTU）、HOBt和二异丙基乙胺（DIEA）为偶合剂先脱保护后依次偶联芴甲氧羰基-半胱氨酸（乙酰胺基甲基／2-氯三苯基）-OH［Fmoc-Cys（Acm／Trt）-OH］、芴甲氧羰基-脯氨酸-OH（Fmoc-Pro-OH）以及芴甲氧羰基-色氨酸（叔丁基羰基）-OH［Fmoc-Trp（Boc）-OH］制到3，3经2%三氟乙酸（TFA）／DCM溶液切割树脂制得三肽化合物9，收率为96.0%；以2-三苯甲基氯树脂为固相载体，在固相反应柱中经DIEA活化偶联芴甲氧羰基-天冬氨酸（氧叔丁基）-OH［Fmoc-Asp（OtBu）-OH］再经DBLK脱Fmoc保护制得10，10采用Fmoc合成法，以HOBt、DIC为偶合剂依次缩合芴甲氧羰基-谷氨酸-OH（Fmoc-Gly-OH）、芴甲氧羰基-高精氨酸（2，2，4，6，7-五甲基苯并呋喃-5-磺酰基）-OH［Fmoc-Har（Pbf）-OH］和巯基丙酸（乙酰胺甲基）-OH［Mpr（Acm）-OH］制得11，11经2%TFA／DCM切割制得四肽化合物12，收率为95.5%。9和12经3H-1，2，3-三唑并［4，5-b］吡啶-3-氧基）三-1-吡咯烷基鏻六氟磷酸盐（PyAOP）、1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑（HOAt）、DIEA采用液相片段缩合制得全保护肽13，13经I2氧化形成分子内的二硫全保护环肽14，14经裂解试剂裂解［v（TFA）∶v（苯甲硫醚）∶v（二巯基乙醇（EDT））∶v（苯酚）∶v（H2O）∶v（三异丙基硅烷（TIS））=81.5∶5∶5∶2.5∶5］制得依替巴肽粗肽，此步收率为99.2%。粗肽经色谱柱制备制得依替巴肽精肽1。此方法采用固液相结合的方法有效提高了收率，但操作步骤繁琐，原料成本较高。

（2）以HBTU、HOBt、DIEA或HOBt、DIC为缩合剂将3接入Fmoc-Asp（OtBu）-OH，再经DBLK脱Fmoc保护得4，4以HOAt、DIC为缩合剂偶联氨基酸三肽片段Mpr（Trt）-Har（Pbf）-Gly-OH制得15，树脂增重率为99.1%。25脱Fmoc保护与经HOBt、DIC活化的Fmoc-Gly-OH缩合得26，26通过30%六氟异丙醇／DCM裂解树脂得Fmoc-Gly-Asp（OtBu）-OH（27），收率为95.2%。29以相同的方法偶联Mpr（Trt）-OH再经裂解得Mpr（Trt）-Har-OH（31），收率为93.1%。27和3制得五肽树脂28，28和31缩合制得全保护七肽树脂15［10］，15经v（TFA）∶v（EDT）∶v（TIS）∶v（H2O）=95∶1.5∶2∶1.5裂解制得还原性依替巴肽16，收率90.3%。16经碘氧化得粗肽，粗肽经高效液相色谱法纯化、转盐得到精肽1，总收率为65.2%，纯度为99.3%。采用多片段缩合，有效地缩短了时间。

（3）芴甲氧羰基-赖氨酸（叔丁基羰基）-OH［Fmoc-Lys（Boc）-OH］经HBTU／0.4MNMM活化与5偶联，再经DBLK脱Fmoc保护制得17，17以相同的方法与Mpr（Acm）-OH缩合得18，18经解离液v（TFA）∶v（TIS）∶v（H2O）=95∶2.5∶2.5脱保护及切割树脂得19，至此收率58.73%，纯度为90%。19与3，5-二甲基吡唑-1-甲脒硝酸盐反应得线性依替巴肽20，收率为85%。20经三氟甲烷磺酸银盐反应制得银肽21，21经碘氧化得粗肽，纯度为85%。粗肽经色谱柱制备得精肽1。此方法创新性的形成银肽，有效的提高了氧化为粗肽的收率，但操作步骤相对复杂。

（4）4-甲氧基三苯基氯甲烷（Mmt-Cl）与Mpr-OH反应制得Mpr（Mmt）-OH（22），22和N-羟基琥珀酰亚胺（HOSu），DCC反应制得碳端保护的23，收率为91.1%，23和高精氨酸盐酸盐缩合制得二肽盐酸盐24，收率为74.1%；24和5以HOBt、DIC为缩合剂偶联制得7，收率为97.7%。5以HBTU、HOBt、DIEA或HOBt、DIC为缩合剂依次偶联Fmoc-Har（Pbf）-OH、Mpr（Trt／Acm）-OH制得7，7经过I2或双氧水氧化制得氧化型侧链全保护依替巴肽8，再经v（TFA）∶v（H2O）∶v（TIS）=95∶2.5∶2.5裂解制得粗肽，粗肽再转盐冻干得精肽，收率为62.3%。6再经脱保护连接Mpr（Trt／Acm）-OH得7，7经裂解试剂v（TFA）∶v（EDT）∶v（TIS）=95∶3∶2或v（TEA）∶v（TA）∶v（TIS）∶v（苯酚）∶v（EDT）∶v（H2O）=80∶5∶4∶2∶5∶4裂解制得线性依替巴肽16，后者收率为85.23%。16在pH=8环境下与2，2'-二硫二吡啶反应制得粗肽，16如果先经二硫苏糖醇（DTT）还原二聚体后再氧化得到粗肽，收率70%以上。DTT还原法有效地减少了环合过程中副产物，提高了粗肽的纯度。

2.液相合成依替巴肽

（1）以Fmoc-Cys（Acm／Trt）-NH2为原料通过HBTU、HOBt、DIEA或HOBt、DIC缩合再经DBLK脱Fmoc保护依次偶合Fmoc-Pro-OH，Fmoc-Trp（Boc）-OH，Fmoc-Asp（OtBu）-OH，Fmoc-Gly-OH制得五肽化合物26，同样Mpr（Trt）-OH和Fmoc-Lys-OMe（27）缩合再脱Fmoc保护得28，28与Boc-NH-C（S）-NH-Boc在有机碱，金属催化剂作用下制得29，29经NaOH溶液水解得二肽化合物30。30和26经缩合得全保护线性七肽31，31经v（TFA）∶v（TIS）∶v（茴香硫醚）∶v（茴香醚）∶v（H2O）=95∶2.5∶2.5∶2.5∶2.5脱保护制得线性依替巴肽32，32在I2氧化得依替巴肽粗肽。粗肽经阴离子交换树脂纯化制得精肽1。此方法用价格较低的Lys代替价格较高的Har，大大减少了原料成本。 以谷氨酸为起始原料与二氯亚砜在甲醇中反应制得谷氨酸甲酯盐酸盐33，33在TEA、1-羟基-1H-1，2，3-三唑-4-羧酸乙酯（HOCt）、DCC下与N-苄氧羰基-高精氨酸-OH（CBz-Har-OH）缩合得34，34经钯碳氢化得NH2-Har-Gly-OMe（35），35用同样的方法偶联Mpr（Acm）-OH制得36，36经氢氧化钡溶液水解，酸中和得三肽化合物Mpr（Acm）-Har-Gly-OH（37）；同理以脯氨酸为原料制得脯氨酸盐酸盐38，与CBz-Trp-OH缩合得39，39经氢化反应得NH2-Trp-OMe（40），40再依次连接CBz-Asp（OtBu）-OH，经氢化得三肽化合物NH2-Asp（OtBu）-Trp-Pro-OCH3（42）；37和42在HOCt、DIC缩合下得43，43通过氢氧化钡溶液水解，酸中和得六肽化合物Mpr（Acm）-Har-Gly-Asp（OtBu）-Trp-Pro-OH（44），44经DIEA、HOCt、DIC反应连接NH2-Cys（Acm）-CONH2制得45，45经v（TFA）∶v（H2O）=95∶5脱保护得半保护线性七肽Mpr（Acm）-Har-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys（Acm）-CONH2（46），46经碘氧化得粗肽，粗肽采用反相液相色谱纯化得依替巴肽精肽1。此方法合成步骤繁琐，但能够实现较好的中控。

（2）33经DIEA活化以HOCt和DIC作为缩合剂偶联N-苄氧羰基-赖氨酸（叔丁基羰基）-OH［Cbz-Lys（Boc）-OH］制得47，47经钯碳还原再经DIEA活化缩合Mpr（Trt）-OH得三肽甲酯化合物49，49经氢氧化钠溶液水解得三肽化合物50；以NH2-Cys（Trt）-CONH2为原料采用Fmoc保护法依次偶联Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Trp-OH、Fmoc-Asp（OtBu）-OH，其中以10%二乙胺／DCM溶液脱Fmoc保护得四肽化合物52；50和52缩合得七肽化合物53，53经I2氧化得环状七肽54，54经乙酸乙酯饱和盐酸溶液制得盐酸环状七肽55，55依次经三氧化硫脲一水合物、10%氢氧化钠溶液、0.2%α-萘酚、次氯酸钠溶液胍基化制得依替巴肽1。采用二乙胺作为脱保护剂较吡啶工业上更为环保。

（3）以NH2-Cys（Trt）-OH为原料在碳酸钠作用下与芴甲氧羰基琥珀酰亚胺（Fmoc-OSu）反应得56［Fmoc-Cys（Trt）-OH］，收率为94%，56和1，1-羰基二咪唑，氨水反应，再经盐酸处理制得57［Fmoc--Cys（Trt）-CONH2］，收率为90%，57经TEA脱Fmoc保护再与L-酒石酸盐成盐制得58［NH2-Cys（Trt）-CONH2L-tartratesalt］；以Fmoc-Har（Pbf）-OH为原料与烯丙基溴和碳酸钙成醚制得芴甲氧羰基-高精氨酸（2，2，4，6，7-五甲基苯并呋喃-5-磺酰基）-O烯丙基［Fmoc-Har（Pbf）-OAll］（59），收率为90%，59经TEA脱Fmoc保护制得NH2-Har（Pbf）-OAll（60），收率为82%，60以HOBt、EDC?HCl、DIEA缩合剂偶联Mpr（Trt）-OH得碳端保护的二肽化合物Mpr（Trt）-Har（Pbf）-OAll（61），61通过三苯基膦钯［Pd（PPh3）4］和吗啉脱碳端保护制得二肽化合物62［Mpr（Trt）-Har（Pbf）-OH］，收率为89%，以同样的缩合方法连接NH2-Gly-OAll?HCl得碳端保护的三肽化合物63，63再经Pd（PPh3）4和吗啉脱保护得三肽化合物37，收率为90%；以NH2-Pro（Boc）-OAll为原料偶联NH2-Trp（Boc）-OH和Fmoc-Asp（OtBu）-OH制得氮端、碳端保护三肽化合物Fmoc-Asp（OtBu）-Trp-Pro-OAll（65），收率为97%，65经烯丙基溴、Pd（PPh3）4、异辛酸钠脱碳端保护得Fmoc-Asp（OtBu）-Trp-Pro-OH（66），收率为86%，66与58缩合制得氮端保护的四肽化合物67，收率为96%，67和37缩合得全保护线性七肽化合物得68，收率为92%，68经DTT还原再经碘氧化得依替巴肽粗肽，粗肽经HPLC纯化得依替巴肽精肽1。

（4）以NH2-Trp-Pro-OH为原料偶联N-苄酯基-天冬氨酸（氧叔丁基）-OSu［Z-Asp（OtBu）-OSu］制得三肽化合物69，69经5%Pd／C氢化得氮端去保护三肽化合物NH2-Asp（OtBu）-Trp-Pro-OH（70），基于氮气保护下收率为95.4%。以Fmoc-Har-Gly-OH为原料和甲磺酸、五氟苯酚、N-乙基吗啉、DCC反应得碳端保护的芴甲氧羰基-高精氨酸-谷氨酸-O五氟苯酚（Fmoc-Har-Gly-OPfp）72，72经N-乙基吗啉（NEM）和70偶联制得五肽化合物73，收率为96.0%。73和半胱氨酸（3-硝基-2-吡啶甲酰氯）-CONH2［NH2-Cys（Npys）-CONH2］经2-（1H-苯并三偶氮L-1-基）-1，1，3，3-四甲基脲四氟硼酸酯（TBTU），再通过DIEA调PH至6.5~7.0缩合得六肽化合物74，收率为87.7%，74与Mpr-OH形成二硫键得化合物75，收率为84.7%，75再经二乙胺脱除高精氨酸氮端保护基Fmoc制得76，76经O-［（乙氧基羰基）氰基甲胺］-N，N，N'，N'-四甲基硫尿四氟硼酸盐和NEM自身缩合得77，77经TFA脱保护制得依替巴肽粗肽，粗肽经高效液相纯化制得精肽1。

【应用】　

主要用于急性冠动脉综合症（ACS），防止心肌供养动脉闭塞，心脏病发作，冠脉介入治疗引起的猝死等 【禁忌证】 以下患者禁用。

1．对依替巴肽过敏者。

2．近30日内有异常出血或有出血倾向者。

3．有出血性脑卒中的病史或近30日内发生脑卒中的患者。

4．肾透析患者。

5．难以控制的严重高血压患者，收缩压大于26.7kPa（200mmHg）或舒张压大于14.7kPa（110mmHg）。

6．近6周内做过大手术的患者。

7．血肌酸酐大于或等于4mg/dl者。

8．血小板计数低于100×109/L者。

9．同时胃肠外使用其他糖蛋白Ⅱb/Ⅲa抑制药的患者。

【注意事项】

1．老人无需调整剂量，但体重小于50kg者，有加重出血的危险性。

2．依替巴肽妊娠安全分级为B级。

3．宜尽量减少血管及其他部位创伤，避免在不易压迫止血部位静脉给药。

4．股动脉穿刺部位止血后及患者停用依替巴肽和肝素后，应至少观察4h。

5．只有活化部分凝血激酶时间（APTT）小于45s时，才可拔掉动脉导管鞘。接受PCI的患者，应在停用肝素并使其药效消失后才可拔掉动脉导管鞘。

6．如发生不能控制的出血，应立即停用依替巴肽和肝素。

7．2～8℃保存。

【不良反应】

1.可出现血压降低。

2．血液：可见淤斑（7%）、血肿（6%）、血尿（0.6%）、血小板减少。有报道，可出现股动脉穿刺部位的大出血（5%～11%）、胃肠道出血（8%）、泌尿生殖道出血（4%）、颅内出血（2%）。

3．中枢神经系统：可出现脑卒中，多为非出血性（脑梗死），尤其是心率过快、年龄偏大、曾患前壁心肌梗死、暂时性脑缺血或脑卒中、糖尿病病史者。

【药物相互作用】

1．与阿加曲班、噻氯匹定、双嘧达莫、低分子肝素、萃布地尼（Treprostinil）、尕古树脂（Guggul）、维生素A、软骨素、多昔单抗、非甾体类抗炎药（如阿司匹林）、抗凝药、溶栓药合用，有增加出血的危险性。

2．与当归、茴香、山金车、小槲树、月见草、绣线菊、小白菊、越橘、红醋栗、墨角藻、睡菜、波多、琉璃苣、猫爪草、芹菜、姜黄素、大蒜、黄芪、辣椒素、生姜、蒲公英、银杏、丁香油、卡法（KAVA）、山楂、甘草、益母草、黄芩、丹参、大黄、红花油合用，有增加出血的危险性。

3．依替巴肽与呋塞米存在配伍禁忌，但可与阿替普酶、阿托品、多巴酚丁胺、利多卡因、哌替啶、美托洛尔、咪达唑仑、吗啡、硝酸甘油、氯化钾、葡萄糖、氯化钠配伍。

【主要参考资料】

[1]赵跃,王菊仙,王玉成.依替巴肽合成路线图解[J].精细化工中间体,2017,47(05):9-14+18.

[2]廖永祥. 血小板糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受体拮抗剂依替巴肽的合成研究[D].山东大学,2010.