0.25%胰酶溶液(不含EDTA 含酚红)的应用

背景^[1-3]

0.25%胰酶溶液(不含EDTA含酚红)含0.25%胰酶，不含EDTA和酚红，溶于无钙镁平衡盐溶液中，经过滤除菌，可以直接用于培养细胞和组织的消化。具有方便快速、稳定安全、细胞状态好等特点。通常室温消化2分钟左右就可以消化下大多数贴壁细胞。

在组织细胞的体外培养和原代细胞培养中的组织细胞分散(将组织块制备成单个细胞悬液)以及传代细胞培养中，贴壁生长细胞的消化分散均要使用组织细胞消化液。常用的消化液为胰蛋白酶，EDTA等，其功能主要是使细胞间的蛋白质(如细胞外基质)水解，使组织或贴壁细胞分散成单个细胞，制成细胞悬液用于进一步的实验。

使用方法：

1.贴壁细胞的消化：

a)吸去培养液，用无菌的PBS、Hanks液或无血清培养液洗涤细胞一次，以去除残余的血清。

b)加入少量胰蛋白酶消化液，盖过细胞即可，室温放置1-2分钟。不同的细胞消化时间有所不同，对于贴壁牢固的细胞可适当延长消化时间。

c)显微镜下观察，细胞明显收缩，并且肉眼观察培养器皿底部发现细胞的形态发生明显的变化;或者用枪吹打细胞发现细胞刚好可以被吹打下来。此时吸除消化液。加入含血清的细胞培养液，吹打下细胞，即可直接用于后续实验。

d)如果发现消化不足，可加入胰蛋白酶消化液重新消化。

e)如果发现细胞消化时间过长，未及吹打细胞，细胞已经有部分直接从培养器皿底部脱落，直接用胰酶细胞培养液把细胞全部吹打下来。1000-2000g离心1分钟，沉淀细胞，尽量去除胰酶细胞消化液后，加入含血清的完全培养液重新悬浮细胞，即可用于后续实验。

2.组织的消化：

不同的组织需要消化的时间相差很大，通常以消化后可以充分打散组织为宜。

应用^[4][5]

用于脑胶质瘤端粒酶反义寡核苷酸纳米微粒的制备及治疗研究

ASODN in NP对C6胶质瘤细胞的抑制作用。实验分5个组:A组.仅加入培养液的空白对照组;B组.未加ASODN的空白NP组（BCA-NP）;C组.游离ASODN组（FREEASODN）;D组.传统吸附制备的NP组（ASODN-NP）;E组.本实验制备的包裹ASODND的NP组（ASODNinNP）。

1. 流式细胞术检测细胞周期:取对数生长期的C6细胞于24孔板中传代培养24h后,加入上述各实验组转染48h后,制成流式细胞检测样品后,上流式细胞仪进行细胞周期分析。

流式细胞仪检测结果发现,转染后与对照组相比,除BCA-NP外,其他各组细胞周期均发生显著变化,其中ASODN in NP组差异非常显著（P<0.01）,表现合成前期（Go/G1）期细胞比例显著增高,DNA合成期（S期）细胞比例减少;与传统的吸附法制备的NP相比,ASODN inNP组也表现出显著性差异（p<0.01）,G2/M期细胞数目无显著变化,说明ASODN in NP可有效阻滞C6胶质瘤细胞于G1期向S期,抑制细胞增殖,促进了细胞凋亡。

2. CCK-8试剂盒测定细胞相对生长率。取传代后处于对数生长期C6细胞,经胰酶消化,低速离心收集,在细胞计数板上记数,调整细胞密度至5×107/L,接种于96孔培养板,置含CO2孵箱中培养,倒置显微镜下观察细胞生长情况;更换培养液,再培养24 h后,将实验各组不同浓度的稀释液（ASODN终浓度分别为5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、30.0μmol）加入各孔细胞上开始转染,以未转染空白组做为对照。

ASODN in NP组与ASODN-NP组加入与ASODN组等量的ASODN,空白对照组只加培养液。培养24h后向每孔加入CCK-8液10μl继续培养4 h,吸弃上层液体,在酶标仪上测定各样品组各孔的450 nm处的吸光度值（A值）,按以下公式计算细胞相对生长率（RGR%）。

RGR%=实验组A值/对照组A值×100%。对C6胶质瘤细胞的生长抑制实验结果表明,通过BCA包裹制备的ASODNin NP,在ASOND相对终浓度5-10μmol/L时,良好的C6细胞生长情况就开始受到抑制,增殖减慢,凋亡增多,其效应优于FREE ASODN和ASODN-NP组,在ASODN相对终浓度10-15μmol/L时表现出较强的抑制效应,且随浓度的增加增殖活力进一步降低,对C6细胞增殖率的剂量依赖性降低趋势显著优于其他各组,可使ASODN能更有效的发挥对胶质瘤细胞的抑制效应。

参考文献

[1]Expression of human telomerase reverse transcriptase splice variantsis well correlated with low telomerase activity in osteosarcoma cell lines[J].Hitomi Fujiwara-Akita,Chihaya Maesawa,Takehisa Honda,Seiichiro Kobayashi,Tomoyuki Masuda.International Journal of Oncology.2005(4)

[2]Cellular lifespan and senescence signaling in embryonic stem cells[J].TakumiMiura,Mark P.Mattson,Mahendra S.Rao.Aging Cell.2004(6)

[3]Enhanced Tumour Uptake of Doxorubicin Loaded Poly(butyl cyanoacrylate)Nanoparticles in Mice Bearing Dalton’s Lymphoma Tumour[J].L.Harivardhan Reddy,R.K.Sharma,R.S.R.Murthy.Journal of Drug Targeting.2004(7)

[4]Incorporation of biodegradable nanoparticles into human airway epithelium cells—in vitro study of the suitability as a vehicle for drug or gene delivery in pulmonary diseases[J].M Brzoska,K Langer,C Coester,S Loitsch,T.O.F Wagner,C.v Mallinckrodt.Biochemical and Biophysical Research Communications.2004(2)

[5]徐越.脑胶质瘤端粒酶反义寡核苷酸纳米微粒的制备及治疗研究[D].南方医科大学,2008.