StemXVivo Serum-Free Dendritic Cell Base Media (250 ML)的应用

背景^[1-3]

StemXVivo Serum-Free Dendritic Cell Base Media(250 ML)是无血清树突状细胞基础培养基培养基成分确定不含血清成分可用于树突状细胞的体外培养。

树突状细胞(dendritic cell,DC)因其表面具有星状多形性或树枝状突起而得名,是科学家Ralph M.Steinman于1973年首先发现的。DC尚无特异性细胞表面分子标志,主要通过形态学、组合性细胞表面标志、在混合淋巴细胞反应中能激活初始T细胞等特征进行鉴定。

DC起源自骨髓多能造血干细胞,分化主要有两条途径:①髓样干细胞在GM-CSF的刺激下分化为DC,称为髓样DC(myeloid dendritic cells,MDC),也称DC1,与单核细胞和粒细胞有共同的前体细胞;

②来源于淋巴样干细胞,与T细胞和NK细胞有共同的前体细胞,称为淋巴样DC(Lymphoid dendritic cells,LDC)或浆细胞样DC(plasmacytoid dendritic cells,pDC),即DC2。DC广泛分布于皮肤、气道、淋巴器官等部位,具有高度异质性,故不同组织中的DC有不同的名称。如分布于皮肤表皮基底层和棘细胞之间的DC称为朗格汉斯细胞。

DC的来源有两条途径：①髓样干细胞在GM-CSF的刺激下分化为DC，称为髓样DC(myeloid dendritic cells，MDC)，也称DCl，与单核细胞和粒细胞有共同的前体细胞；包括朗格汉斯细胞（Langerhans cells，LCs），间皮（或真皮）DCs以及单核细胞衍生的DCs等。

②来源于淋巴样干细胞，称为淋巴样DC(Lymophoid dendritic cells，LDC)或浆细胞样DC(plasmacytoid dendritic cells，piX；)，即DC2，与T细胞和NK细胞有共同的前体细胞。树突状细胞(DC)尽管数量不足外周血单核细胞的1%，但表面具有丰富的抗原递呈分子(MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ)、共刺激因子(CD80/B7-1、CD86/B7-2、CD40、CD40L等)和粘附因子(ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、LFA-1、LFA-3等)，是功能强大的专职抗原递呈细胞(APC)。DC自身具有免疫刺激能力，是惟一能激活未致敏的初始型T细胞的APC。

应用^[4][5]

用于小鼠骨髓源未成熟及成熟树突状细胞培养及其上清液中细胞因子水平变化的研究

利用改良son法体外培养未成熟DC及成熟DC细胞,分析比较两种细胞培养上清液中IL-23、IL-35的表达量,探讨IL-23、IL-35在DC细胞的正性免疫应答及免疫耐受机制中的意义,为MS的治疗寻求新的方向。

方法:1离体分离培养未成熟及成熟树突状细胞取清洁级C57BL/6雌鼠,拉颈处死,依次浸泡于碘伏、75%酒精、75%酒精5min、2min、2min。无菌弯镊及剪刀剥离干净小鼠腿部肌肉,浸泡股骨于无菌磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)之中2min,无菌纱布擦拭股骨表面,浸泡于含有青链霉素的RPMI-1640培养液中。

于股骨两端及中央打孔,无菌RPMI-1640冲洗骨髓腔,200目细胞筛过滤、红细胞裂解液裂解红细胞、RPMI-1640清洗。使用含10%胎牛血清、10ng/ml白细胞介素4(interleukin-4,IL-4)、10ng/ml粒细胞巨噬细胞刺激因子(granulocytemacrophage colony-stimulating factor,GM-CSF)的RPMI-1640悬浮骨髓液,调整细胞浓度为1×106/ml,接种于六孔板。

分别于48h、96h全量及半量换液,补充细胞因子,第5天收集悬浮细胞即为未成熟树突状细胞(immature dendritic cells,imDCs);第6天补充细胞因子干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ),第7天收集悬浮细胞即为成熟树突状细胞(mature dendritic cells,mDCs)。

分别收集第5天及第7天悬浮细胞,离心,CD11c标记,无菌条件下经流式细胞仪分选,收集CD11c+细胞,即为未成熟及成熟树突状细胞。

3细胞鉴定荧光倒置显微镜观察细胞形态；扫描电镜观察细胞表面形态；透射电镜观察细胞内部超微结构；流式细胞学检测细胞表面CD11c、MHCII、CD80、CD86分子表达情况分别于第5天及第7天收集六孔板中悬浮细胞,流式细胞仪检测细胞表面CD11c、MHCⅡ、CD80、CD86的分子表达情况。

参考文献

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[3]IL‐35:A potential therapeutic target for controlling hepatitis B virus infection[J].Xiao Gang Xiang,Qing Xie.Journal of Digestive Diseases.2015(1)

[4]Tolerogenic Splenic IDO+Dendritic Cells from the Mice Treated with Induced-Treg Cells Suppress Collagen-Induced Arthritis[J].Jie Yang,Yiming Yang,Huahua Fan,Hejian Zou,Ethan M.Shevach.Journal of Immunology Research.2014

[5]单明月.小鼠骨髓源未成熟及成熟树突状细胞培养及其上清液中细胞因子水平变化的研究[D].河北医科大学,2016.