N-芴甲氧羰基-3-[[(4-甲氧基苯基)甲基]硒基]-L-丙氨酸的制备

背景及概述^[1]

N-芴甲氧羰基-3-[[(4-甲氧基苯基)甲基]硒基]-L-丙氨酸是一种硒代氨基酸原料，简称Fmoc-Sec(PMB)OH，可将硒代氨基酸掺入蛋白质。N-芴甲氧羰基-3-[[(4-甲氧基苯基)甲基]硒基]-L-丙氨酸可由β-氯-L-丙氨酸为反应原料通过三步反应制备。

制备^[1]

第1步：硒代胱氨酸的合成。

将β-氯-L-丙氨酸（5.0g，31mmol）溶解于水（40mL）中，并将所得溶液的pH调节至9.0，然后在30-60分钟将上述溶液滴加到Na2Se2溶液中。将混合物在Ar（g）下于37℃搅拌12-16小时，然后将溶液用浓HCl酸化直至剧烈反应停止，并加入羟胺（0.33g，9.7mmol）以还原残留的元素硒。加入另外的浓HCl，直到不再与溶液剧烈反应为止，将所得溶液用Ar（g）冲洗至少1小时（硒化氢废气用乙酸铅的饱和水溶液捕集），然后过滤溶液，将黄色滤液的pH调节至6-6.5。硒代半胱氨酸的浓度高，立即形成黄色沉淀，将沉淀物溶解在尽可能的最小体积的2NHCl中，过滤得到的深黄色溶液，并通过添加10NNaOH将滤液的pH增加至6-6.5，分离出硒代胱氨酸，为亮黄色结晶固体4.1g，产率为60％。

第2步：Sec（PMB）OH的合成。

将硒代胱氨酸（1.8 g，5.3 mmol）溶于0.5 N NaOH（5 mL）。 在搅拌下，将溶于水（10 mL）的NaBH₄（1.7 g，43 mmol）逐滴添加至100 mL圆底烧瓶中的硒代胱氨酸溶液中，将烧瓶冷却以防止沸腾。 剧烈反应平息后（溶液从黄色变为无色），滴加冰醋酸直至pH接近6.0。然后将对甲氧基苄基氯（1.44 mL，10.6 mmol）滴加至溶液中。反应迅速进行并在30分钟内完成。 Se-苄基化的白色晶体硒代半胱氨酸与一些硒代半胱氨酸一起明显出现，呈黄色晶体。溶液用浓盐酸酸化，直至白色沉淀完全形成，然后通过热水结晶纯化，分离为白色固体的Sec（PMB）OH-HCl 2.5 g，产率为72％。

第3步：N-芴甲氧羰基-3-[[(4-甲氧基苯基)甲基]硒基]-L-丙氨酸

将Sec（PMB）OH-HCl（1.2 g，3.7 mmol）溶解在水中（10 mL）制成浆液。将三乙胺（0.52 mL，3.7 mmol）加入到100 mL圆底烧瓶中的浆液中。将溶解在乙腈（10mL）中的Fmoc-O-琥珀酰亚胺（1.25g，3.7mmol）加入溶液中，然后加入另一当量的TEA。加入额外的乙腈，直到所有溶质完全溶解。将所得溶液在室温搅拌加热1小时，并通过TLC监测反应进程。在二氯甲烷中，Fmoc-Sec（PMB）OH不会迁移，但反应中的杂质，尤其是二苯并富勒烯具有很高的迁移率。1小时后，将反应混合物用1 N HCl酸化（5 mL），然后用乙酸乙酯萃取。将有机层用1N HCl洗涤（3x）。然后，将所得合并的水相用乙酸乙酯萃取（3x）。合并乙酸乙酯萃取物，并用MgSO₄干燥。过滤后，将有机层在减压下浓缩以产生黄色油。将该油状物溶于二氯甲烷（10–20 mL）中，并通过硅胶柱色谱纯化。当用CH2Cl2充分洗涤柱洗脱出反应中的杂质，主要是二苯并富勒烯。用甲醇/ CH₂Cl₂（1：4）洗脱Fmoc-Sec（PMB）OH。减压除去溶剂，分离出Fmoc-Sec（PMB）OH，为淡黄色结晶固体1.0 g，收率为53％。

参考文献

[1] Hondal R J , Nilsson B L , Raines R T . Selenocysteine in native chemical ligation and expressed protein ligation.[J]. Journal of the American Chemical Society, 2001, 123(21):5140.