骨化二醇的含量测定和分离纯化

背景及概述^[1-2]

骨化二醇(calcifediol)是人体内维生素D3(VD3)在肝脏的VD3羟化酶的作用下转化而来，对空气、热、光敏感，易溶于乙醇等极性有机溶剂，不溶于水。由美国Upjohn公司上世纪八十年代开发上市，用于治疗老年人骨质疏松症等各种慢性骨紊乱，以及与慢性肾衰竭有关的代谢性骨病。

维生素D2和D3被吸收后首先经肝脏维生素D-25羟化酶系统羟基化为25-羟代谢物，即骨化二醇，然后骨化二醇在肾脏经维生素D-Ⅰ羟化酶系统催化，形成1，25-双羟维生素D3(骨化三醇)，才具有生物活性作用。骨化二醇血药浓度达峰时间约为4小时，作用持续时间为15～20日，肾功能衰竭时作用时间延长2～3倍。半衰期为10～22日。

用法用量^[1]

口服：初量，每周0.3～0.35mg，分为每日或隔日1次，需要时4周后增加用量。一般每日服0.05～0.1mg或隔日服0.1～0.2mg就有疗效。血钙浓度正常病人隔日服0.02mg，即有效。2岁以上小儿口服：每日0.02～0.05mg;2～10岁，每日0.05mg。10岁以上用量可参照成人用量。

含量测定^[2]

谢洪兵等人报道了快速准确地测定维生素D3微生物转化液中骨化二醇含量的方法。采用依利特HypersilC18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm),流动相为乙腈-水(85∶15),流速2.0mL·min^-1,柱温50℃,检测波长265nm,外标法定量。结果：骨化二醇在10.1~2020μg·mL^-1内呈良好线性关系,r=0.9999,定量限0.6ng,检出限0.3ng,平均加样回收率为101.06%(RSD1.44%,n=9)。结论：该方法简便,准确,灵敏度高,分离度好,可用于VD3微生物转化生产中定量骨化二醇的要求。

分离纯化^[3]

（1）、在微生物酶催化维生素D3生成骨化二醇（25-羟基维生素D3）转化液中，按照体积比1:1加入乙酸乙酯，震荡萃取1h，收集上层有机溶剂，得到骨化二醇提取液a。

（2）、将上述骨化二醇提取液a，经过减压浓缩，回收乙酸乙酯，用甲醇重新溶解浓缩物，调整骨化二醇浓度在0.5mg/L，得到上柱溶液b。

（3）、琼脂糖凝胶过滤层析经活化后，采用湿法装柱，将上柱溶液b以2BV/h的流速通过琼脂糖凝胶过滤层析柱，选用层析分子量为400Da，以1BV的乙酸乙酯做为洗脱液，以2BV/h的流速对其进行洗脱，收集洗脱液，在60℃，压力-0.08MPa条件下，减压浓缩，干燥，得到纯度32.1%的骨化二醇产品。

参考文献

[1]实用药物手册

[2]谢洪兵,曾志刚,翟龙飞.反相高效液相色谱法测定维生素D_3微生物转化液中骨化二醇含量[J].中国药学杂志,2015,50(01):72-74.

[3] [中国发明,中国发明授权] CN201910121462.1 一种新型骨化二醇（25-羟基维生素D3）分离纯化方法