增强型DAB显色试剂盒的应用

背景^[1-3]

增强型DAB显色试剂盒是一种借助辣根过氧化物酶(HRP)，用于免疫组化显色、原位杂交显色或Western、Southern、Northern、EMSA等膜显色的试剂盒。DAB（二氨基联苯胺）是辣根过氧化物酶的常用底物。在辣根过氧化物酶的催化下，DAB会产生棕色沉淀。该棕色沉淀不溶于水和乙醇。本产品采用特殊配方，灵敏度高，背景低，重复性好，储存稳定，使用方便，适合于蛋白印迹、免疫组织化学和免疫细胞化学、斑点印迹和生物芯片等的染色和显色反应。增强型DAB显色试剂盒含有检测辣根过氧化物酶(HRP)的所有试剂，适合于检测各种印迹膜上标记的HRP。其反应原理是HRP可以催化底物DAB在目的蛋白所在的位置转变为深褐色的化合物，可根据颜色的有无和深浅来检测HRP的存在与否或存在量，进而推测HPR标记物识别的靶分子的位置及含量。

操作说明：

1.对于组织切片或蛋白质印记膜，在与辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗体或其它形式的探针孵育后，用适当洗涤液洗涤3-5次，每次3-5分钟。

2.向5 ml蒸馏水中加入250μl溶液A、250μl溶液B、250μl溶液C，并混合均匀，即为DAB工作液，1h内使用。注意：溶液A/B/C必须完全融化后使用。

3.向组织切片或膜上加入适量DAB工作液，确保能充分覆盖样品。

4.室温避光孵育1-30分钟，显色时间过长可引起本底增高，故应密切观察显色过程（一般3-10分钟最理想），并在本底较浅且达到适当显色强度时以流水漂洗终止显色反应。

5.对于组织切片或细胞样品，显色反应终止后可对其进行其他染料复染。对于膜，显色反应终止后，可以室温晾干避光保存。

应用^[4][5]

用于DAB2IP在胰腺癌中的异常表达及其意义的研究

采取免疫组化二步法的方法对DAB2IP在上述胰腺癌组织及癌旁组织、正常胰腺组织中的表达进行检测,并观察其表达水平与胰腺癌患者各临床及病理参数之间的关系。石蜡切片组织常规二甲苯脱蜡,梯度浓度酒精水化；新鲜配制的柠檬酸钠溶液(PH=6.0)高温高压蒸汽3分钟抗原修复,3%过氧化氢室温避光封闭10分钟；PBS泡洗3次,5分钟／次,10%羊血清室温封闭10分钟,然后滴加一抗(Abcam公司,兔抗人多克隆抗体)DAB2IP(1:200),4℃孵育过夜；次日在室温下复温至少半小时后,PBS泡洗3次,5分钟／次；二抗(HRP标记的兔鼠通用抗体,来源于上海基因科技公司的GTVision免疫组化试剂盒)室温孵育30分钟,PBS泡洗3次,5分钟／次；DAB显色,苏木精复染,经返蓝、脱水、透明及封片后在光学显微镜下观察和分析。

参考文献

[1]Low expression of DAB2IP contributes to malignant development and poor prognosis in hepatocellular carcinoma[J].XiaojingZhang,NingLi,XianzhengLi,WeiZhao,YudanQiao,LiLiang,YanqingDing.Journal of Gastroenterology and Hepatology.2012(6)

[2]Epothilone B Confers Radiation Dose Enhancement in DAB2IP Gene Knock-Down Radioresistant Prostate Cancer Cells[J].Zhaolu Kong,Pavithra Raghavan,Daxing Xie,Thomas Boike,Sandeep Burma,David Chen,Arup Chakraborty,Jer-Tsong Hsieh,Debabrata Saha.International Journal of Radiation Oncology,Biology,Physics.2010(4)

[3]Inactivation of Ras GTPase-activating proteins promotes unrestrained activity of wild-type Ras in human liver cancer[J].Diego F.Calvisi,Sara Ladu,Elizabeth A.Conner,Daekwan Seo,Jer-Tsong Hsieh,Valentina M.Factor,Snorri S.Thorgeirsson.Journal of Hepatology.2010(2)

[4]Decreased Expression of the RAS-GTPase Activating Protein RASAL1 Is Associated With Colorectal Tumor Progression[J].Miki Ohta,Motoko Seto,Hideaki Ijichi,Koji Miyabayashi,Yotaro Kudo,Dai Mohri,Yoshinari Asaoka,Motohisa Tada,Yasuo Tanaka,Tsuneo Ikenoue,Fumihiko Kanai,Takao Kawabe,Masao Omata.Gastroenterology.2009(1)

[5]段伊帆.DAB2IP在胰腺癌中的异常表达及其意义的研究[D].南方医科大学,2013.