禽流感病毒H6亚型(AIV-H6)核酸试剂盒(荧光-PCR法)的应用

背景^[1-3]

禽流感病毒H6亚型(AIV-H6)核酸试剂盒(荧光-PCR法)针对禽流感病毒H6亚型HA基因高度保守区域设计特异性引物和探针，在反应体系中含禽流感病毒H6亚型基因组模板的情况下，PCR反应得以进行并释放荧光信号。利用仪器对PCR过程中相应通道的信号强度进行实时监测和输出，实现检测结果的定性、定量分析。

禽流感病毒H6亚型(AIV-H6)核酸试剂盒(荧光-PCR法)

检验原理

禽流感病毒H6亚型(AIV-H6)核酸试剂盒(荧光-PCR法)采用RT-PCR技术，针对甲型流感（禽流感）病毒H6亚型的基因高度保守区域设计特异性引物，用RT-PCR技术对甲型流感（禽流感）病毒H6亚型的核酸进行体外扩增检测，在反应体系中含甲型流感（禽流感）病毒H6亚型核酸模板的情况下，RT-PCR反应进行特异性扩增，利用琼脂糖凝胶电泳技术对RT-PCR扩增产物进行检测，依据特异性扩增片段的结果，判断待检样品中是否含有甲型流感（禽流感）病毒H6亚型成分，实现检测结果的定性分析。

禽流感病毒H6亚型(AIV-H6)核酸试剂盒(荧光-PCR法)特点：

1.一站式，用户不需要单独准备每种成分，包括引物和对照。

2.根据甲型流感（禽流感）病毒H6亚型的保守基因序列设计的引物，具有良好的特异性。

3.灵敏度可以达到1000拷贝/反应。

4.使用一管式RT-PCR技术，RT和PCR两步在一个试管内完成，不需要中间转移样品，降低了操作误差和可能的污染。

5.本产品足够50次20μL体系的RT-PCR。

适用仪器：ABI7500、安捷伦MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf等系列荧光定量PCR检测仪。

样本类型：病死或扑杀禽，取喉气管、脑、胸肌、心肌和肺等组织；待检活禽，用棉拭子取呼吸道分泌物或排泄物，置于1mL 50%甘油生理盐水中。

保存和运输：上述标本短期内可保存于-20℃，长期保存可置-70℃，但不能超过6个月，标本运送应采用2~8℃冰袋运输，严禁反复冻融。

禽流感病毒H6亚型(AIV-H6)核酸试剂盒(荧光-PCR法)操作流程：

1.样本处理：每份组织分别从3个不同的位置称取样品约1g，手术剪剪碎混匀后取0.5g于研磨器中研磨，加入1.5mL生理盐水后继续研磨，待匀浆后转至1.5mL灭菌离心管中，8000rpm离心2min，取上清液100μL于1.5mL灭菌离心管中；棉拭子直接取100μL于1.5mL灭菌离心管中。

2.试剂配制：加入预混反应液、酶及模板，离心混匀。

3.扩增检测：运行预设程序（如：95℃预变性2min，95℃15s→60℃30s，45循环），分析Ct值。

结果判读

阳性：检测通道Ct值≤40，且曲线有明显的指数增长曲线；

阴性：样本检测结果Ct值>40或无Ct值。

应用^[4][5]

禽流感病毒H6亚型(AIV-H6)核酸试剂盒(荧光-PCR法)可以用于鸭源H6N6亚型禽流感病毒的分离鉴定与致病性分析

实验于2014年11月从表观健康三穗鸭泄殖腔分离鉴定得到一株H6N6亚型AIV,通过对其全基因组测序、遗传进化和致病性分析,旨在为家鸭中H6亚型AIV流行病学及遗传进化情况提供参考。

1. H6N6亚型AIV分离鉴定及遗传进化分析:为了解贵州地区H6亚型AIV的流行情况和遗传进化特点,本研究采用鸡胚接种、血清学和RT-PCR方法从表观健康的三穗鸭泄殖腔分离鉴定得到一株H6N6亚型AIV(命名为A/duck/Guizhou/013/2014（H6N6）,并对其进行部分生物学特性测定、全基因组测序与遗传进化分析。结果表明,分离株HA裂解位点是“339PQIETRG345”,为非连续碱性氨基酸,其MDT和ICPI分别为98.4 h和0.415,符合低致病性AIV的特征。BLAST结果显示分离株HA基因与A/chicken/Hunan/S41912/2009（H6N2）的核苷酸同源性最高（97.1%）;NA基因与A/duck/Eastern China/48/2010（H6N6）的相似性最高（97.0%）;而PB2基因与A/duck/Yamagata/061004/2014（H6N6）的同源性最高（96.9%）,M基因与NP基因则分别与A/duck/Jiangsu/4/2010（H3N6）和A/duck/Hokkaido/Vac-1/04（H5N1）同源性最高。以上研究结果表明,贵州省分离到的H6N6亚型AIV是一株弱毒株,其基因组可能是由H6N2、H3N6和H5N1等多个亚型病毒重组而成。

2.鸭源H6N6亚型AIV对鸭致病性研究:为了解鸭源H6N6亚型AIV对麻鸭的致病性,将36只3周龄非免疫麻鸭随机分成两组:实验组以107.0EID50/0.1 mL的剂量通过滴鼻点眼方式接种病毒;对照组接种0.1 mL PBS。接种后分别于第1、3、5、7、9和11 d,采集咽喉和泄殖腔棉拭子,同时采集剖杀鸭的组织脏器（心、肝、脾、肺、肾、脑、法氏囊、胸腺）,通过禽流感病毒H6亚型(AIV-H6)核酸试剂盒(荧光-PCR法)来检测病毒排毒和组织脏器中病毒含量。另外,取部分脏器用于病理组织学检查。禽流感病毒H6亚型(AIV-H6)核酸试剂盒(荧光-PCR法)试验结果表明,鸭感染分离株后不表现明显的临床症状,咽喉和泄殖腔未出现排毒现象。鸭感染后第3、5和7d在肺脏、脾脏、肝脏、脑、心脏均可以检测到病毒复制,除肺脏中第3 d病毒含量较高外,其它时间点的组织中病毒含量均不高。另外,病理组织学观察发现,在肺脏中可见少量炎性细胞浸润,其它组织无明显的病理变化。以上试验结果表明分离的H6N6亚型AIV对鸭的致病力弱,且在鸭体内的复制能力低。

试验分离到一株低致病性H6N6亚型AIV,该病毒可能是由H6N2、H3N6和H5N1等多个亚型AIV重组而成;鸭感染分离株后无明显临床症状和病理组织学变化,喉头和泄殖腔不存在排毒现象;分离株对鸭免疫器官损伤轻微,并且对免疫器官中IL-2、IL-10和IFN-α转录水平有影响。

参考文献

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[5]陈佳琪.鸭源H6N6亚型禽流感病毒的分离鉴定与致病性分析[D].贵州大学,2016.