人丝氨酸蛋白酶抑制因子肽酶抑制因子进化枝3G(SERPINA3G)ELISA KIT的应用

背景^[1-3]

人丝氨酸蛋白酶抑制因子肽酶抑制因子进化枝3G(SERPINA3G)ELISA KIT用纯化的抗体包被微孔板，制成固相载体，往包被抗该指标抗体的微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的抗该指标抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成的黄色。颜色的深浅和样品中的该指标呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

操作步骤

1.加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100μl，余孔分别加标准品或待测样品100μl，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37℃反应120分钟。

为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。

2.弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加生物素标记抗体工作液100μl（取1μl生物素标记抗体加99μl生物素标记抗体稀释液的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制），37℃,60分钟。

3.温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，350μl/每孔，甩干。

4.每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液（同生物素标记抗体工作液）100μl，37℃，60分钟。

5.温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分钟，350μl/每孔，甩干。

6.依序每孔加底物溶液90μl，37℃避光显色（30分钟内，此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度蓝色，后3-4孔梯度不明显，即可终止）。

7.依序每孔加终止溶液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。

8. 用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度（OD值）。在加终止液后15分钟以内进行检测。

应用^[4][5]

用于蝎丝氨酸蛋白酶抑制剂Sj7170促神经胶质瘤生长和转移研究

神经胶质瘤是成人中最常见的原发性恶性脑瘤。目前被确诊为神经胶质瘤的患者,大约有一半是处于晚期阶段,神经胶质瘤患者平均预期的寿命约为14-18个月左右,因而神经胶质瘤是恶性程度最高的肿瘤之一。现有的科学研究表明神经胶质瘤侵袭行为的分子机制十分复杂且仍不清楚。因此,作为分子工具的神经胶质瘤调节剂(激活剂和抑制剂)的发现将有助于揭示神经胶质瘤发生的分子机制,也有利于研发治疗和诊断神经胶质瘤的药物和技术。

丝氨酸蛋白酶抑制剂(SPIs)广泛存在于各种生物体及其组织中,如寄生虫、吸血性无脊椎动物、两栖类动物的皮肤和有毒动物的毒腺分泌物,SPIs具有重要的生理/病理功能。近来研究表明Serpin和Kunitz家族的SPIs能导致肿瘤细胞恶性程度的增高。然而,所有报道的SPIs均是由内源性的人类细胞所分泌的,还没有任何关于外源性SPIs促肿瘤作用的报道,并且内源性SPIs促肿瘤的分子机制仍然不清楚,更为重要的是,SPIs促肿瘤研究还从未涉及神经胶质瘤。因此,发现新型SPIs并研究其促神经胶质瘤作用及其机制具有重要的科学意义与应用价值。

参考文献

[1]SdPI,the first functionally characterized Kunitz-type trypsin inhibitor from scorpion venom.R.Zhao,H.Dai,S.Qiu,T.Li,Y.He,Y.Ma,Z.Chen,Y.Wu,W.Li,Z.Cao.PloS one.2011

[2]Rho GTPases in cell biology.Etienne-Manneville S,Hall A.Nature.2002

[3]Cyclin D1 governs adhesion and motility of macrophages.Neumeister Peter,Pixley Fiona J,Xiong Ying,Xie Huafeng,Wu Kongming,Ashton Anthony,Cammer Michael,Chan Amanda,Symons Marc,Stanley E Richard,Pestell Richard G.Molecular Biology.2003

[4]Risk factors for meningioma in adults:a case-control study in northeast China.Hu J,Little J,Xu T,Zhao X,Guo L,Jia X,Huang G,Bi D,Liu R.International journal of cancer.Journal international du cancer.1999

[5]宋妤.蝎丝氨酸蛋白酶抑制剂Sj7170促神经胶质瘤生长和转移研究[D].武汉大学,2014.