质粒中量提取试剂盒

概述^[1]

本试剂盒采用碱裂解法裂解细菌，再通过离心吸附柱在高盐和低pH条件下高效结合溶液中的DNA。离心吸附柱中采用的特制玻纤膜材料可高效、与一吸附DNA。本试剂盒适用于提取5-30 ml过夜培养的大肠杆菌，质粒提取得率和质量与不宿主菌的种类和培养条件、细胞的裂解、质粒拷贝数、质粒的稳定性、抗生素等因素有关。使用本试剂盒提取的质粒DNA可适用于各种常规操作，包括酶切、PCR、测序、连接、转化、文库筛选、体外翻译、转染一些常规的传代细胞等。

试剂盒组成^[1]

储存条件^[1]

试剂盒可置于室温（15-25℃）干燥条件下，可保存12个月，更长时间的保存可置于4℃。注意：次使用前将RNase A加入Solution I中混匀后建议置于4℃保存；Solution III 建议置于4℃保存。

注意事项^[1]

1. Solution I 在使用前应先加入RNase A（将试剂盒中提供的RNase A全部加入），混匀后4℃保存。

2. Solution II 如有混浊现象，可在37℃水浴中加热几分钟，即可恢复澄清。使用后应立即盖紧盖子，以避免空气中的CO₂不Solution II 中的NaOH反应，从而造成溶液裂解效率下降。

3. DNA Wash Buffer 在使用前先加入无水乙醇（按试剂盒包装规定的体积加入）。

4. 所有离心步骤均为使用常规台式离心机室温下进行离心。

5. 去蛋白液PE可以有效去除残留的蛋白污染，当宿主菌为endA+（TG1、BL21、HB101、ET12567、JM系列）等核酸酶含量较高的菌株时，则推荐使用去蛋白液PE。

操作方法^[1]

1. 取5-30 ml过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，4,000 rpm 离心3 min，尽量吸除上清（菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中）。

2. 向有菌体沉淀的离心管中加入2 ml Solution I（已加入RNase A），使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀，然后静置5 min。

注意：如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。

3. 向离心管中加入2 ml Solution II，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。

注意：温和地混合，不要剧烈震荡，以免打断基因组DNA，造成提取的质粒中混有基因组DNA片断。此时菌液应变得清亮粘稠，所用时间丌应超过5min，以免质粒受到破坏。如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解丌彻底，应减少菌体量。

4. 向离心管中加入2.8 ml Solution III，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。12,000rpm离心10 min。

注意：Solution III 加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。

5. 将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱中 （吸附柱放入收集管中），注意尽量丌要吸出沉淀。12,000 rpm离心30 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。

6. 可选步骤：向吸附柱中加入3.5 ml去蛋白液 Solution PE，12,000 rpm离心30 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。如果宿主菌是end A+宿主菌（TG1，BL21，HB101，JM系列，ET12567等），这些宿主菌含有大量的核酸酶，易降解质粒DNA，推荐采用此步。如果宿主菌是endA-宿主菌（DH5α，TOP10等），这步可省略。

7. 向吸附柱中加入3.5 ml DNA Wash Buffer（使用前请先检查是否已加入相应体积的无水乙醇），12,000 rpm离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。

8. 重复操作步骤7。

9. 将吸附柱放入收集管中, 12,000 rpm离心1 min，将吸附柱中残余的漂洗液去除。

10. 将吸附柱开盖，置于室温放置3-5 min，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

11. 将吸附柱置于一个干净的15ml离心管中，向吸附膜的中间部位滴加0.5-1.0 ml洗脱缓冲液Elution Buffer（或者ddH₂O），室温放置2 min，12,000 rpm离心2 min将质粒溶液收集到离心管中。注意：将洗脱缓冲液Elution Buffer（或者ddH₂O）预热至60℃将有助于提高质粒洗脱的效果。

主要参考资料

[1] 质粒中量提取试剂盒（离心柱型）