上皮生长因子样域酪氨酸激酶2抗体的应用研究

背景^[1-3]

上皮生长因子样域酪氨酸激酶2抗体是一种可以特异性结合上皮生长因子样域酪氨酸激酶2的免疫球蛋白。抗体是具有4条多肽链的对称结构，其中2条较长、相对分子量较大的相同的重链(H链)；2条较短、相对分子量较小的相同的轻链(L链)。链间由二硫键和非共价键联结形成一个由4条多肽链构成的单体分子。抗体（Antibody），又称免疫球蛋白（Immunoglobulin，简称Ig），是一种由B细胞分泌，被免疫系统用来鉴别与中和外来物质如细菌、病毒等的大型Y形蛋白质，仅被发现存在于脊椎动物的血液等体液中，及其B细胞的细胞膜表面一般是用上皮生长因子样域酪氨酸激酶2作为抗原对特定实验动物进行系统免疫后制得的抗体蛋白，主要用于需要检测上皮生长因子样域酪氨酸激酶2的相关实验。

以酶联免疫吸附实验为例将内皮细胞TEK酪氨酸激酶(Tie2)抗体包被于96孔微孔板中，制成固相载体，向微孔中分别加入标准品或标本，其中的内皮细胞TEK酪氨酸激酶(Tie2)与连接于固相载体上的抗体结合，然后加入生物素化的内皮细胞TEK酪氨酸激酶(Tie2)抗体，将未结合的生物素化抗体洗净后，加入HRP标记的亲和素，再次彻底洗涤后加入TMB底物显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的内皮细胞TEK酪氨酸激酶(Tie2)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(O.D.值)，计算样品浓度。

应用^[4][5]

用于以Tie2为靶标的抗肿瘤血管生成的研究

Tie2／TEK是胚胎血管发育和肿瘤血管形成都需要的内皮细胞酪氨酸激酶受体，血管生成素Angl(angiopoietin)是其配体，正常成人组织中，Angl／Tie2受体水平较低，用于维持成熟的血管结构；一般癌组织中．Angl／Tie2的表达较为活跃。Angl／Tie2在血管形成中具有重要调节作用；可溶性Tie2在体液中同配体Angl结合，阻止血管内皮细胞上的Tie2受体酪氨酸激酶的磷酸化，阻断了Angl／Tie2信号传导系统的传导，使血管不能生成，所以可溶性Tie2在治疗肿瘤方面有一定的前景。从上面的论述我们知道：要想阻断Angl／Tie2系统的信息通路，有以下两种方法：1．表达可溶性Tie2片段，用它去中和游离的Angl；2．制备抗Tie2抗体，阻断Angl和Tie2受体结合。基于以上两点从胎盘组织中克隆出Tie2基因的膜外区，将Tie2的前360个氨基酸同IgG的Fc融合，插入B7载体，并在CH0中表达可溶性Tie2片段，ELISA检测出Tie2蛋白。构建一个半合成抗体库，不经免疫制备人源抗Tie2 Fab抗体。通过RT-PCR方法，从人脐带血淋巴细胞总RNA扩增轻链基因及部分重链VH段基因，将轻链基因插入DCOMb3载体中，得人轻链质粒库；从HBsAb的Fd段基因制备含有不同长度随机化CDR3的FR3-CDR3-J-CH1片段，然后将VH段基因与随机化的CDR3融合，得到Fd基因片段，再将其插入轻链质粒库中，得半合成人Fab质粒库。通过多次建库，获得总容量为2×107的半合成抗体库。其Fd段和轻链基因的重组率为50％。用Tie2抗原包被ELISA板条，经三轮淘洗，从噬菌体抗体库中筛选到与Tie2抗原特异结合的噬菌体克隆。测序确定所得抗体的基因序列，胚系基因分析表明该抗体基因重链属于VH4基因家族，是DP-66、D7-27、JH3a重排产物；轻链属于Vκ1家族，是DPκ3，Jκ2重排产物。重链CDR3的区序列，符合最初的(NNK)8的随机化设计。

参考文献

[1]Quantification of vascular tortuosity as an early outcome measure in oxygen induced retinopathy(OIR)[J].Andrew Scott,Michael B.Powner,Marcus Fruttiger.Experimental Eye Research.2014

[2]Ectopic expression of human angiopoietin-1 promotes functional recovery and neurogenesis after focal cerebral ischemia[J].Z.Meng,M.Li,Q.He,S.Jiang,X.Zhang,J.Xiao,Y.Bai.Neuroscience.2014

[3]Angiopoietin-1 regulates microvascular reactivity and protects the microcirculation during acute endothelial dysfunction:Role of eNOS and VE-cadherin[J].Alessio Alfieri,Albert C.M.Ong,Richard A.Kammerer,Tirupa Solanky,Simon Bate,Mohammed Tasab,Nicola J.Brown,Zoe L.Brookes.Pharmacological Research.2014

[4]Long-term Outcomes in Patients with Retinal Vein Occlusion Treated with Ranibizumab[J].Peter A.Campochiaro,Raafay Sophie,Joel Pearlman,David M.Brown,David S.Boyer,Jeffrey S.Heier,Dennis M.Marcus,Leonard Feiner,Arun Patel.Ophthalmology.2014(1)

[5]廖振林.以Tie2为靶标的抗肿瘤血管生成的研究[D].中国人民解放军军事医学科学院,2004.