醋酸海沙瑞林的用途和制备

背景及概述[1][2]

醋酸海沙瑞林，中文名：海沙瑞林，英文名：Hexarelin,结构式：His-D-2-Me-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH2，分子式及分子量：C47H58N12O6；887.0

近几年研究发现，凋亡引起心肌细胞丢失是心力衰竭发生的重要机制之一，血管紧张素II(Angiotension II)是心力衰竭发生时的一种重要神经内分泌因子，可诱导心肌细胞凋亡。大量资料表明，hexarelin对心血管系统有明显保护作用。通过研究表明Hexarelin可明显抑制AngII诱导的心肌细胞凋亡。心肌细胞肥大是心力衰竭的重要发病过程之一，而hexarelin有明显抗Ang II诱发的心肌细胞肥大以及对SHR心肌肥厚的作用。通常合成GHRH系列多肽如GHRH-2，GHRH-6等采用Boc法，每步脱Boc均需用TFA，使用MBHA或AM Resin，用强刺激、巨毒的氟化氢切割，还有是通过液相法片断缩合，周期比较长。相对于以上二种，限制了醋酸海沙瑞林的大规模生产和使用。而随着Fmoc氨基酸的商品化程度越来越高，成本的下降，Fmoc固相法是比较快速，方便，可以大量规模化生产的方法。

制备[1]

固相多肽合成醋酸海沙瑞林的方法：

(1)制备Fmoc-Lys(Boc)-Linker AM Resin

称取Fmoc-Linker-AM Resin 1g(Loadding：0.6mmol/g)倒入30ml接肽瓶，加入大约树脂15mlDCM，浸泡10分钟(常温)后用真空泵抽干，加入脱帽试剂10ml放入恒温振荡器反应5分钟，用真空泵抽干，重新加入脱帽剂10ml反应15分钟(30℃～40℃)，用真空泵抽干，用工业级的DMF洗涤3次，无水甲醇洗涤3次，重蒸过的DCM洗涤3次，加入Fmoc-Lys(BOC)-OH0.702g、HOBt0.337g、分析级的DMF8ml、DIC0.2ml、Collidine0.3ml反应40分钟(30℃～50℃)，用真空泵抽干，用工业级的DMF洗涤3次，无水甲醇洗涤3次，重蒸过的DCM洗涤3次，抽干，获得Fmoc-Lys(Boc)-LinkerAM Resin；

(2)制备Fmoc-D-Phe-Lys(Boc)-Linker AM Resin

在步骤(1)的Fmoc-Lys(Boc)-LinkerAM Resin中，加入脱帽试剂，30～60℃反应5分钟，抽干，重新加入脱帽剂30～60℃反应15分钟，抽干，洗涤，加入Fmoc-D-Phe-OH0.581g、HOBt0.337g、分析级的DMF8ml、DIC0.2ml、Collidine0.3ml反应40分钟(30℃～50℃)，抽干，洗涤，抽干，获得Fmoc-D-Phe-Lys(Boc)-Linker AM Resin；其余操纵以及工艺条件同上；

(3)制备Fmoc-Trp(BOC)-D-Phe-Lys(Boc)-Linker AM Resin

在步骤(2)的Fmoc-D-Phe-Lys(Boc)-Linker AM Resin中，加入脱帽试剂反应5分钟，抽干，重新加入脱帽剂反应15分钟，抽干，洗涤，，加入Fmoc-Trp(BOC)-OH0.790g、HOBt0.337g、分析级的DMF8ml、DIC0.2ml、Collidine0.3ml反应40分钟(30℃～50℃)，抽干，洗涤，，抽干，获得Fmoc-Trp(BOC)-D-Phe-Lys(Boc)-Linker AM Resin；

其余操纵以及工艺条件同上；

(4)制备Fmoc-Ala-Trp(BOC)-D-Phe-Lys(Boc)-Linker AM Resin

在步骤(3)的Fmoc-Trp(BOC)-D-Phe-Lys(Boc)-Linker AM Resin中，加入脱帽试剂反应5分钟，抽干，重新加入脱帽剂反应15分钟，抽干，洗涤，加入Fmoc-Ala-OH0.467g、HOBt0.337g、分析级的DMF8ml、DIC0.2ml、Collidine0.3ml反应40分钟(30℃～50℃)，抽干，洗涤，抽干，获得Fmoc-Ala-Trp(BOC)-D-Phe-Lys(Boc)-Linker AM Resin；其余操纵以及工艺条件同上

(5)制备Fmoc-D-2-Me-Trp-Ala-Trp(BOC)-D-Phe-Lys(Boc)-Linker AM Resin

在步骤(4)的Fmoc-Ala-Trp(BOC)-D-Phe-Lys(Boc)-Linker AM Resin中，加入脱帽试剂反应5分钟，抽干，重新加入脱帽剂反应15分钟，抽干，洗涤，加入Fmoc-D-2-Me-Trp-OH0.635g、HOBt0.337g、分析级的DMF8ml、DIC0.2ml、Collidine0.3ml反应40分钟(30℃～50℃)，抽干，洗涤，抽干，获得Fmoc-D-2-Me-Trp-Ala-Trp(BOC)-D-Phe-Lys(Boc)-Linker AM Resin；其余操纵以及工艺条件同上。

(6)制备Fmoc-His(Trt)-D-2-Me-Trp-Ala-Trp(BOC)-D-Phe-Lys(Boc)-Linker AMResin

在步骤(5)的Fmoc-D-2-Me-Trp-Ala-Trp(BOC)-D-Phe-Lys(Boc)-Linker AM Resin中，加入脱帽试剂反应5分钟，抽干，重新加入脱帽剂反应15分钟，抽干，洗涤，加入 Fmoc-His(Trt)-OH0.929g、HOBt0.337g、分析级的DMF8ml、DIC0.2ml、Collidine0.3ml反应40分钟(30℃～50℃)，抽干，洗涤，抽干，获得Fmoc-His(Trt)-D-2-Me-Trp-Ala-Trp(BOC)-D-Phe-Lys(Boc)-Linker AM Resin其余操纵以及工艺条件同上

(7)在步骤(6)的Fmoc-His(Trt)-D-2-Me-Trp-Ala-Trp(BOC)-D-Phe-Lys(Boc)-LinkerAM Resin中，加入脱帽试剂反应5分钟，抽干，重新加入脱帽剂反应15分钟，抽干，用工业级的DMF洗涤3次，无水甲醇洗涤3次，重蒸过的DCM洗涤3次，用无水乙醚抽干(用真空泵一直抽约半小时)，树脂成很干的颗粒，所述的树脂为Fmoc-His(Trt)-D-2-Me-Trp-Ala-Trp(BOC)-D-Phe-Lys(Boc)-Linker AM Resin

(8)把抽干的Fmoc-His(Trt)-D-2-Me-Trp-Ala-Trp(BOC)-D-Phe-Lys(Boc)-Linker AMResin倒入25ml玻璃的茄型瓶，加入8ml预冷-5℃～-10℃的切肽试剂(TFA/EDT/p-Cresol/DCM＝80/2.5/2.5/15，体积比)，20℃～40℃切肽反应2～3小时，过滤除去树脂，加乙醚沉淀，离心，用乙醚反复洗涤6次，在室温，置干燥器中减压抽干(一般为5～8小时)，获得海沙瑞林粗品0.520g。按照本发明，粗品经C18柱分离纯化的方法包括如下步骤：将海沙瑞林粗品溶于25％ACN水溶液中，过滤，滤液经C18色谱柱纯化，流动相有两种：A：0.1％TFA+99.9％ACN；B：0.1％TFA+99.9％H2O；梯度：22％～30％；流速为110ml/min；检测波长为220nm；用液相色谱仪跟踪所需要的流出液，样品峰合并后浓缩去ACN，转醋酸海沙瑞林，浓缩小体积冻干，获得成品0.243g(MW：887.0)，总收率为46.73％ (以树脂的mmol计)。

主要参考资料

[1] CN200810043346.4 固相多肽合成海沙瑞林的方法