花色素的主要制备方法

背景及概述^[1]

花色素为自然界植物特有的水溶性色素，具有2－苯基苯并吡喃阳离子结构，即典型的B环邻二苯酚结构，与黄酮的2－苯基色原酮结构相似，又称为类黄酮类化合物。目前，已鉴定出花色素的单体种类超过20种，仅其中的6种单体最为常见，即矢车菊素、飞燕草素、天竺葵素、芍药色素、矮牵牛素和锦葵色素，分别占植物可食用花色素的50%、12%、12%、12%、7%和7%。作为一种苷元，花色素的化学性能极不稳定，易与不同的单糖、双糖、三糖及其修饰物结合，尤其是结合3－单糖配体、3－双糖配体、3，5－双糖配体与3，7－双糖配体，其中更易与3－糖配体结合而成为花色苷。野草莓苷是缔纹天竺素－3-半乳糖苷，矢车菊双苷是矢车菊素-3，5-二葡萄糖苷，芍药花苷是金银草素-3，5-二葡萄糖苷，堇菜花苷是飞燕草素-3-鼠李糖葡萄糖苷加对羟基桂皮酸。花色素和花色苷类大多可溶于水、乙醇等亲水性溶剂，不溶于乙醚、苯、氯仿等。其水溶液常因pH改变而表现出不同的颜色。

花色素及其花色苷单体^[2]

1. 矢车菊素及其花色苷单体

自然界中以矢车菊素为苷元的花色苷在植物花色苷中占据着“半壁江山”，其易得性及与生俱来的生物活性使其在抗肿瘤活性上的研究方面得到关注。基于杨梅矢车菊素-3-葡萄糖苷单体对SGC7901、AGS、BGC823等三种胃癌细胞增殖的体外抑制实验表明，其可降低癌细胞MMP－2蛋白的表达，浓度为42.5μg/mL24h的抑制率分别为92.66%、92.26%和90.67%。研究矢车菊素－3－葡萄糖苷单体和曲妥单抗协同对MDA－MB－453、BT－474和HCC1569等三种乳腺癌细胞活性的影响，表明1μg/mL矢车菊素－3－葡萄糖苷和20μg/mL曲妥单抗协同作用，可使24h和48h的乳腺癌细胞活性显著低于对照组；进一步的机制分析认为，矢车菊素－3－葡萄糖苷无论是单独使用还是与曲妥单抗协同，都能下调表皮因子受体HEＲ2、磷酸化AKT和MAPK的表达。

2. 飞燕草素单体

飞燕草素是6种常见花色素中羟基数量最多的一种，其酚羟基的数量在一定程度上决定了其生物学活性。飞燕草素对人胶质母细胞瘤细胞U－87的转移有明显的抑制作用，主要与其B环邻二苯酚以及3号位的羟自由基的存在密切相关，飞燕草素通过上调溶酶原激活因子(uPA)以及下调纤溶酶原激活抑制剂(PAI－1)而抑制肿瘤细胞迁移。研究多种花色素诱导白血病细胞HL－60凋亡以及对小鼠肿瘤诱发的作用，发现只有在B环上存在邻二苯酚结构的花色素(即飞燕草素)才表现出诱导HL－60细胞凋亡以及抑制小鼠肿瘤发生的作用［25－26］。

3. 锦葵色素及其花色苷单体

锦葵色素B环上仅在4'上有一个羟基，是6种花色素中甲基化程度最高的一类。比较了锦葵色素和飞燕草素对结肠癌细胞HT－29细胞活性的抑制作用，结果表明100μmol/L的锦葵色素单体和飞燕草素单体在对细胞作用24h后其细胞活性分别为对照组的26%与44%，进一步显示锦葵色素较之飞燕草素对结肠癌细胞HT－29的细胞活性有更强的抑制作用。从锦葵色素单体及其花色苷的来源上，或购于试剂公司，或从水稻中提取；在抗肿瘤活性方面，可抑制结肠癌与白血病等癌细胞的细胞活性，且均比飞燕草素单体或矢车菊素花色苷有更强的抑制作用。

4. 天竺葵素及其花色苷单体

天竺葵素B环上3'和5'为氢原子，在4'上也有一个羟基，属于非甲基化花色素。探讨自红心萝卜中提取的酰基化天竺葵素－3－槐糖－5－葡萄糖苷单体对肝癌细胞Bel－7502细胞活性的影响，结果表明0.25mmol/L作用癌细胞48h后的细胞活性约为对照的70%。研究发现50μmol/L天竺葵素对肝癌细胞HepG2和结肠癌细胞LS174T作用24h后细胞的CYP1A1mＲNA表达增加。自葡萄皮中提取的天竺葵素对胃癌细胞AGS、结肠癌细胞HCT－116、肺癌细胞NCIH460和乳腺癌细胞MCF－7作用48h后的半抑制率分别为176.6、154.3、182.1、136.5μg/mL。从天竺葵素单体及其花色苷的来源上，或购于试剂公司，或从葡萄皮以及红心萝卜中提取；在抗肿瘤活性方面，对肝癌、胃癌、结肠癌、肺癌细胞和乳腺癌细胞增殖都有一定的抑制作用。

5. 芍药色素及其花色苷

芍药色素B环3'和5'位置上分别连接氧甲基和氢原子。芍药色素－3－葡萄糖苷单体对结肠癌细胞SW480的增殖有显著的抑制作用，细胞周期阻滞在S期；进一步地，含有芍药色素、矢车菊素和天竺葵素等花色苷的紫甘薯提取物，比相同浓度的芍药色素－3－葡萄糖苷单体对SW480增殖表现出更强的抑制作用。采用黑米花色苷提取物中的芍药色素－3－葡萄糖苷对乳腺癌细胞HS578T的活性抑制进行了实验，显示其通过阻滞乳腺癌细胞HS578T周期在G2/M期而表现出良好的细胞活性抑制作用；此外，芍药色素－3－葡萄糖苷还下调了细胞周期蛋白CDK－1、CDK－2、cyclinB1和cyclinE的表达。

6. 矮牵牛素及其花色苷

矮牵牛素B环3'和5'位置上连接则是氧甲基和羟基。研究结果表明200μg/mL自葡萄皮中提取的矮牵牛素对乳腺癌细胞MCF－7和胃癌细胞AGS作用48h后的细胞增殖抑制率分别为53%和24%。研究自葡萄皮提取的矮牵牛素－3－葡萄糖苷单体对胃癌细胞MKN－28、结肠癌细胞Caco－2和乳腺癌细胞MCF－7增殖的影响，结果表明浓度为100μmol/L的矮牵牛素－3－葡萄糖苷作用48h后对三种癌细胞增殖抑制率分别为25%、30%和60%。

制备^[3]

高效天然植物花色素的提取方法：

(一)将天然植物的黑米花色苷水溶液用β-葡萄糖苷酶水解，用L-半胱氨酸抗氧化，保护β-葡萄糖苷酶的活性；水解温度50℃，PH5，时间24小时；得到含花色素/花色苷/葡萄糖的水溶液，含有在酸性水溶液中分散的油溶性的相对密度小于1的脂肪酸或脂肪酸脂杂质；脂肪酸或脂肪酸脂杂质是指油酸或/和棕榈酸，对油酸或/和棕榈酸含量低的花色苷水溶液需加入适量的油酸或/和棕榈酸的酸脂，以使能够在下述(三)中完全悬浮分离花色苷水溶液中的花色素钠盐；

(二)、用碳酸氢钠NaHCO中和上述(一)的花色苷水解水溶液至PH7，花

青素生成其钠盐；

(三)、将上述(二)加入氯化钠Nacl，配制上述(二)的含花色素钠盐/花色苷/葡萄糖的水溶液的盐饱和水溶液；具体配制方法，为节约能源，在25℃时，以此温度下的氯化钠Nacl在水中的饱和溶解度量为参考值，再将该数值的氯化钠Nacl加入此含花色素/花色苷/葡萄糖的水溶液溶解，静置1-3分钟，使过量的氯化钠立即沉淀析出分离；再取出含花色素/花色苷/葡萄糖/氯化钠的水溶液；静置8小时，使脂肪酸或脂肪酸脂杂质裹挟、吸附、物理结合水不溶的花色素钠盐的结合物因其相对密度小于氯化钠Nacl饱和水溶液的相对密度而呈固体水不溶物密集悬浮分离；而与花色苷和葡萄糖及氯化钠的水溶液分离；

(四)、取出上述(三)的花色素钠盐与脂肪酸或脂肪酸脂的结合物，过滤其中的水分；再将此花色素钠盐与脂肪酸或脂肪酸脂的结合物加入其体积10倍的食用软水，在5℃时加入适量氯化钠Nacl或达到其饱和水溶液浓度，使其水溶液的相对密度大于1；再在5℃时静置24小时，使脂肪酸或脂肪酸脂呈固体油脂状密集悬浮分离，此时花色素钠盐也大多聚集沉淀分离；花色素钠盐的相对密度大于1.8，远大于氯化钠Nacl的饱和水溶液相对密度；脂肪酸或脂肪酸脂必要时在上述(一)中部分循环利用；

(五)、在50℃时，过滤或分层取出上述(四)的花色素钠盐；再用稍过量的质量比10％的盐酸Hcl水溶液与花色素钠盐搅拌反应，搅拌速度500转/分钟，使花色素钠盐与盐酸Hcl水溶液充分反应，生成氢H还原的花色素沉淀物和氯化钠；花色素钠盐与盐酸Hcl水溶液的料液质量比为1比10；过滤或分层取出花色素沉淀物，在1℃-25℃下用少量食用水洗涤其中的盐酸，沉淀分离花色素，得到花色素固体物；再真空脱水干燥，得到与天然花色素化学结构相同的花色素产品；含微量花色素的盐酸水溶液循环利用。

主要参考资料

[1] 中国大百科全书（化学卷）

[2] 花色素及其花色苷单体抗肿瘤活性研究进展

[3] CN201710356456.5高效天然植物花色素的提取方法