牡丹酚的主要制备方法

背景及概述^[1][2]

牡丹根皮含有牡丹酚、芍药甙、没食子酸、挥发油0.15～0.4％植物淄醇、牡丹酚甙、没食子酸葡萄糖、牡丹酚原甙、氧化芍药甙等，因此牡丹不仅具有很高的观赏艺术价值，且有很好的养生、美容、药用价值。

牡丹酚经现代医学证明，具有镇静、催眠、抗菌、抗炎、抗氧化、降血压、能够抑细胞内氧自由基的产生能使皮肤增白，并将皮肤中沉积的色素，还原退色，清淤化斑、清肿止痛、抗过敏、抗病毒，对色斑、肌肉痛、皮肤瘙痒、牛皮癣、带状疱疹；妇女痛经、闭经具有较好的治疗和保健作用，促进面部肌肤血液循环、活化衰老表皮细胞，消除皱纹、去斑、润肤、美容也有较好的功效。牡丹酚及多酚类物质有一定量的R·OH基，能够形成有抗氧化作用的氧自由基以消除超氧阴离子和羟自由基等自由基的活性。从而保护组织免受氧化作用的损伤，以提高其免疫功能、抗癌、抗衰老，因此已被称作“第七大营养素”。因氧损伤导致许多慢性疾病，如：心血管病症、衰老的主要原因，多酚的抗氧化功能可以对这些慢性疾病起到预防的作用，对能产生过氧化作用而导致结构和功能损伤的超氧化阴离子和羟自由基有明显的消除作用。作为一种很强的抗氧化剂可以抑制DL胆固醇氧化。DL胆固醇即坏胆固醇，是血液中的“杂质”可以引起冠心病和心肌梗塞死等。其物理性可用紫外分光光度计测定，在274nm波长E(1％cm)为862紫外光区有强烈吸收，因此又有防晒的功效。

制备^[1]

目前常用的从牡丹根皮中提取牡丹酚的方法有三种。一、醇提法以无水乙醇为溶剂，40℃温度下回流提取，即可将牡丹酚提取出来。醇提法提取工艺简单，有效成分提取多，似应为牡丹皮提取的方法，但问题在于牡丹酚熔点低、挥发性强，而醇提法提取过程中受热温度高、时间长,大大降低了牡丹酚的提取率。二、蒸馏－煎煮法蒸馏-煎煮法是指先蒸馏提取挥发性成分，药渣再加水提取的方法，适用于含挥发性成分药材的提取。牡丹酚随蒸气馏出后，在冷藏状态下大量析出，滤过干燥即可用于成型，保存方便且转移率较高，但其提取率远低于醇提法。三、CO2超临界流体萃取法：应用超临界萃取法是当前中草药有效成分提取一个发展方向，具有提取温度低、时间短等优点，但是提取量少。目前还未见有关于利用乙醇以及CO2超临界流体萃取制备牡丹酚的方法。

CN201610767084.0报道了一种牡丹酚的提取方法，具体步骤如下：

（1）取牡丹根皮粉碎，过40目筛，以3-6重量倍乙醇为夹带剂，用CO2超临界提取，具体参数为：萃取釜温度65-72℃，萃取压力11-14MPa，流速10-12L/h，提取时间5-6小时；分离釜：温度52-56℃，分离压力7MPa；第二分离釜：温度40-43℃，分离压力3-4MPa；制得牡丹根皮CO2超临界萃取物A；

（2）将步骤（1）中的牡丹根皮CO2超临界萃取物A通过大孔吸附树脂吸附，用浓度为10-20％的乙醇预洗，再以流速10-12L/h、浓度为50-80％的乙醇洗脱，收集的洗脱液为药液B；

（3）将药液B在60-65℃范围内浓缩得稠膏C；

（4）取稠膏C以纯化水提取5-6次，提取液冷却至0-10℃，静置24-30h，过滤，并在25-30℃范围内，浓缩成无醇稠膏D，即得牡丹酚。

作为本发明进一步的方案：所述步骤（1）中CO2超临界提取，具体参数为：萃取釜温度68℃，萃取压力12MPa，流速11L/h，提取时间6小时；分离釜：温度54℃，分离压力7MPa；第二分离釜：温度42℃，分离压力3.5MPa；制得牡丹根皮CO2超临界萃取物A。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明提高了牡丹酚的提取率，缩短了提取时间，降低了提取温度，本发明提取条件温和，所用试剂均无毒，全部纯天然萃取，无添加，无着色，提取的牡丹酚可用于食用等用途，口感清纯，风味独特，保存了天然活性成分，以利于人体吸收。

图1是本发明的工艺流程图。

药理作用^[2]

牡丹酚与可接受的辅料，制成散剂，添加至饲料中，混匀，按日常饲料量喂食鸡；或将牡丹酚制成牡丹酚水溶性粉剂，溶于水中，按日常饮水量喂食鸡。通过动物感染实验证实牡丹酚的抗球虫指数(ACI)可达到180以上，具有较好的抗柔嫩艾美耳球虫作用。

纯化方法^[3]

一种牡丹酚的层析分离纯化方法，其包括以下步骤：

(a)细胞破碎：冷冻保存的牡丹丹皮破碎前一天取出，在室温下解冻→称取牡丹丹皮提取物悬液，记录体积和质量→加入等体积50毫摩尔PBS(pH6.8)→样品装在烧杯中，超声细胞粉碎机进行细胞破碎，每个破碎周期间隙时间1s，超声时间2s；总时间30min；在冰浴下进行。每隔5min用玻棒沿烧杯壁轻轻搅动，使破碎更完全，破碎后的样品记为样品1。

(b)盐析：将步骤(a)取得的样品1→4℃冷冻离心(8000rpm，30min)，去沉淀→加入适量固体(NH4)2SO4，使达28％饱和→4℃静置→4℃冷冻离心(8000rpm，30min)，去沉淀→上清液中加入适量(NH4)2SO4，使达50％饱和→4℃静置→4℃冷冻离心(8000rpm，30min)，去上清。所得样品记为样品2。固体(NH4)2SO4用量参考硫酸铵沉淀试剂表。(NH4)2SO4用前先碾匀，加(NH4)2SO4的过程要缓慢，并一边轻轻搅拌，加完(NH4)2SO4后继续搅拌几分钟。

(c)透析：收集步骤(b)盐析所得的沉淀，装入透析袋，排除气泡，用透析夹封住袋口一将装有样品的透析袋置于合适容器中加入lO毫摩尔PBS缓冲液，开始透析，透析数小时。所得的样品记为粗提液。

(d)选择柱层析：牡丹提取物牡丹酚分离纯化过程中，不同的的层析柱在洗脱条件等方面不尽相同。在柱型及洗脱条件的选择上参考各种填料的性质并进行改进。

(e)装柱：选取合适规格层析柱→竖直固定柱子→调整流出管高度→往预加水/缓冲液的柱子中，小心装入处理好的填料(HA、DEAE、DEAE-SepharoseFastFlow和SephadexG-X系列)→平衡。装柱过程应避免气泡产生，用蓝色葡聚糖2000过柱，检验装柱效果。

(f)上样走柱：上样前，用搅拌器小幅度搅动，使柱顶端部分填料重悬→静置→待液面与柱面相隔约1mm时，沿层析柱内壁旋转加入样液，注意不要破坏柱面。

(g)洗脱干燥获得成品：样品完全进入柱体后，加入适量洗脱缓冲液，调整好各相关仪器(包括梯度洗脱器、搅拌器、恒流泵、核酸蛋白检测仪及记录仪和自动部分集器等)，开始洗脱，洗脱结束干燥后获得牡丹酚成品。

主要参考资料

[1][中国发明]CN201610767084.0一种牡丹酚的提取方法

[2]CN201310471618.1牡丹酚在制备抗柔嫩艾美耳球虫药物中的应用

[3][中国发明]CN201410391884.8一种牡丹酚的层析分离纯化方法