粪肠球菌的主要应用

背景及概述^[1]

肠球菌属是将原先LancerieldD组的链球菌，即粪链球菌(Streptococcusfaecalis)和屎链球菌(Streptococcusfaecium)重新定名为粪肠球菌和屎肠球菌。自1984年建立肠球菌属以来，有9个种是来自于原先的链球菌属，并新增加了10个新种。粪肠球菌（Enterococcusfaecalis）是国家农业部公告第2045号公布的《饲料添加剂目录（2013）》允许用于养殖动物的微生物，就目前粪肠球菌作为添加剂使用的剂型，有水剂和粉剂两大类，其水溶液剂型因菌体容易利用水剂中的营养性物质继续代谢，生长发酵，因此，这种剂型的菌体处于不稳定状态，保存期较短。粉剂剂型则是将活的菌体利用低温热风、冷冻等干燥手段，将菌体进行慢速脱水，使菌体处于稳定的干燥休眠状态，再利用可以饲用的物质作为填充物质混合均匀制成较为稳定的粉剂型生物饲料添加剂。但就目前生产企业考虑到原材料的易得和加工成本，常选用米糠、麸皮、玉米粉、玉米芯粉、花生壳粉、贝壳粉、蛭石粉、石粉、碳酸钙、麦饭石、沸石粉中的一种或几种混合物，有的还使用植物秸秆粉或草粉作为填充料。这些本着生产成本的考虑，则忽略了微生物菌的稳定性和饲料添加剂的营养性价值。

形态^[2]

粪肠球菌为肠球菌属中最常见的即为代表种，粪肠球菌又叫粪链球菌，菌形圆或椭圆，可顺链的方向延长，直径0.5-1.0微米，大多数成双或短链状排列，通常不运动。在丰富培养基上菌落大而光滑，直径1-2mm，全缘，罕见色素。其营养要求低，在普通营养琼脂上也可生长。能在10℃或45℃pH9.6或含6.5％NaCl肉汤培养基中生长，并能耐65℃30分钟。它可利用精氨酸为能源，发酵山梨醇，不发酵阿拉伯糖。在简单的培养基上生长不需叶酸。粪肠球菌生活在人体肠道里，通常对人体不仅无害而且有益。但它有时也会引发严重感染，并对抗生素有抵抗力。

应用^[3-4]

肠球菌是一类革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性的微生物，能利用葡萄糖进行同型发酵，产生L型乳酸，也能从氨基酸降解中获得能量。它们拥有磷酸烯醇丙酮酸磷酸转移酶系统(PEP-PTS)，从而能够吸收利用乳糖和其他的碳水化合物，包括葡糖酸。肠球菌常被用作食品安全的指示菌，它可能与通过食物传染的疾病有关。在南欧生产的干酪中，人们用肠球菌作为发酵剂。此外，商业上人们也利用它们作为益生菌，以便预防和治疗肠道菌群失调疾病。所有肠球菌中，仅有粪肠球菌和屎肠球菌可以作为重要的益生菌。这两种肠球菌可以借助它们对阿拉伯糖和山梨糖醇的发酵状况，借助它们在生长温度等方面的差异区分开来。粪肠球菌是人和动物肠道中的正常菌群，也是一种重要的乳酸菌，具有较好的肠道粘附能力，能产生乳酸及一些抗菌物质，抑制肠道腐败菌、致病菌的繁殖及肠道感染，降低腹泻率，促进营养物质的消化吸收，增强免疫力，提高采食量及饲料转化率，促进动物健康，是畜牧生产及食品工业首选使用的益生菌菌种之一。

制备^[5]

一种粪肠球菌发酵培养工艺是采用固体发酵培养工艺，包括：

（1）制备粪肠球菌种子液：用MRS液体培养基培养获得，MRS液体培养基配方：蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g，柠檬酸氢二铵2.0g，葡萄糖20.0g，吐温801.0mL，乙酸钠5.0g，磷酸氢二钾2.0g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，远离子水用蒸馏水1000mL，pH6.2～6.6，灭菌条件为121℃，20～30min；每50毫升灭菌后的液体培养基装于250毫升三角瓶中，接种斜面粪肠球菌种子一接种环，放置于摇床上培养18～24小时，即得到粪肠球菌种子液。

（2）营养液培养基制备：制备固态发酵过程中需要流加的营养液培养基，配方为：葡萄糖：5～20.0g，蛋白胨：1～10.0g，牛肉膏：1～5.0g，酵母膏：1～5.0g，硫酸镁0～0.5g，硫酸锰0～0.2g，磷酸氢二钾：0.5～3.0g，去离子水1000ml，pH6.5～7.2；

（3）固态发酵培养基配制和灭菌：固态发酵培养基包括麸皮、玉米粉、豆粕、米糠、颗粒活性炭等，在固态培养基料中再加入上述营养液培养基作为固态发酵培养基营养液，再加入采自宜春四一四矿的含有镧、铈有效元素用于饲料稀土添加剂的稀土（市售获得）作为促培养剂，固态培养基：液体培养基：稀土比例为1：1.0～1.3：0.0001，拌匀后灭菌，灭菌条件为121℃，20～30min。

（4）固态发酵培养：对灭菌冷却后的固态发酵培养基接种培养：按接种量5～20%，在灭好菌的固态发酵培养基中接入粪肠球菌种子液，在30～37℃无菌环境下培养24～72h。

（5）培养过程中营养液培养基和固态发酵培养基的流加操作：培养20小时后，将上述灭菌冷却后的营养液培养基用碳酸钠调节PH值到8.5，即成为碱性营养液，按碱性营养液：固态发酵培养基为0.3：1的比例加入碱性营养液，于无菌环境中简单翻料搅拌几分钟，继续培养，培养到40小时时，重复上述的补充流加碱性营养液的操作，再继续培养到72小时时即培养完毕。

（6）干燥粉碎：出料后，于35～50℃下通风干燥至含水量10%以下时结束。粉碎至60目即为粪肠球菌高密度固态发酵成品，用平板培养检测法检测粪肠球菌其含活菌量达到350～500亿/g。固态培养基料的各组分的加入量，粪肠球菌种液接入固态发酵培养基的量均可按现有技术的配比或接入量计加入，而饲料用稀土添加剂可由市售获得，并按说明添加。

主要参考资料

[1]来源：现代乳品工业手册

[2] CN200710018997.3优良粪肠球菌的筛选制备方法及其应用

[3] CN201810511947.7一种粪肠球菌饲料添加剂

[4] CN201510230840.1一种固态发酵制备粪肠球菌的方法

[5] CN201110268516.0高密度粪肠球菌及其发酵培养工艺