9004-07-3

以牛胰脏为原料，经提取、分级盐析后先制成胰凝乳蛋白酶原，经胰蛋白酶激活后，再用硫酸铵、乙醇重结晶精制而得。

牛宰杀后1h内取出胰脏，用硫酸在0℃浸取。浸取液用硫酸铵分级盐析，盐析物溶于冷蒸馏水（用硫酸调节pH），再用硫酸铵和氢氧化钠调节pH，使结晶完全，反复溶解，再结晶，得到糜蛋白酶元结晶。将糜蛋白酶元结晶活化、盐析、透析、干燥，即得糜蛋白酶。

绞碎、提取牛宰杀后，迅速取出牛胰（一般在0.5 ～1h内），洗净，去掉脂肪、结缔组织等杂物，立即浸入预先冰冻好的硫酸溶液（0.125mol/L)中，骤然冷却，在⁰C左右保存，待积满100kg后投料。取胰投入绞肉机中绞碎成胰浆（必要时应绞3次），加入胰浆2倍量的冰冷硫酸（0.125mol/L）。置冷室中，每1 ～2h搅拌1次，浸渍提取24h。浸渍物用粗滤袋（或二层纱布）过滤，滤干后滤渣再用1倍量冷硫酸液（0.125mol/L重复上过程，再进行过滤，弃滤渣，合并2次滤液，每升滤液中加入固体硫酸铵使浓度为242g,此时硫酸铵浓度达到40%饱和度，冷室放置，过夜，虹吸上清液，底层沉淀加入适量硅藻土作助滤剂，减压过滤，上清液和滤液合并，得提取液。
牛胰^{冰冷H₂SO₄}→_提取提取液
分级盐析、结晶每升提取液中加入固体硫酸铵205g,使硫酸铵浓度达到70%饱和度，冷室放置过夜，次日上层清液弃去，底层沉淀减压过滤至干，加入3倍于滤饼重的冰水使之溶解，重复用硫酸铵40%和70%饱和度分级沉淀，取第2次７０％饱和度沉淀滤饼，加入1.5倍于滤饼重的冰水溶解，并加入0.5倍滤饼重量的饱和硫酸铵溶液，用氢氧化钠（5mol/L）调Ph5,于25⁰C恒温箱中静置，保温48h进行结晶（取结晶液一滴置载玻片上用100倍显微镜观察，应有明显针状结晶），再将结晶减压抽滤至干，得糜蛋白酶原粗制品，按牛胰质量计算，收率5%～6%。取粗制胰蛋白酶原加入7倍量冰冷蒸馏水，使之溶解，并滴加硫酸（2.5mol/L)调节Ph达到2左右，溶液置布氏漏斗上用酸洗滑石粉过滤，滤液应澄清，再加入2倍量饱和硫酸铵溶液，滴加氢氧化钠（5mol/L）中和酸度使Ph为5左右，在20～25⁰C条件下，保温静置4h以上，即有白色沉淀析出，显微镜下观察为棒状结晶，过滤弃滤液，沉淀再按此法重复结晶3次，得糜蛋白酶原结晶。
提取液^{(NH₄)₂SO₄}→_分级盐析沉淀^{(NH₄)₂SO₄;NaOH;Ph4}^→_结晶糜蛋白酶原
活化、盐析、结晶称取糜蛋白酶原结晶，加入3倍于该量的冰冷蒸馏水并滴加硫酸溶液，使之溶解，然后加入等量的Ph7.6磷酸盐缓冲溶液（0.5mol/L）和一定量的氢氧化钠[与（2）中2.5mol/L硫酸的物质量相当]，使Ph保持在7.6，再在每100g的糜蛋白酶原中加入150倍以上的胰蛋白酶5mg。置于5⁰C的冰箱中，使之活化48h。用硫酸（0.5mol/L）调节Ph达到4左右，在每升的活化液中加入固体硫酸铵0.5kg，盐析并放置2h，溶液置布氏漏斗减压过滤，弃去滤液，沉淀物用3/4倍量的硫酸（0.005mol/L），酸洗滑石粉澄清，加入少量晶种，于20～25⁰C静置24h，当大量的结晶生成时，过滤，即得糜蛋白酶结晶。
糜蛋白酶原^{冰冷；胰蛋白酶；50}→_活化活化
^{H₂SO₄;Ph4}→_{盐析；结晶}糜蛋白酶结晶
透析、灭菌、干燥称取糜蛋白酶结晶，加入3倍于该量的蒸馏水，并滴加硫酸溶液（0.005mol/L），使之溶解，每350ml装入一个透析袋中，使透析袋浸于5⁰的水浴中，并使内外溶液处于同一平面上，用水连续透析2～ 3d，透析应完全。
糜蛋白酶结晶⁵⁰→_透析 透析液^{冷冻；减压}→_{灭菌；干燥}成品

酶活力4000ATEE U/mg(单位定义：25℃，pH=7.0条件下每分钟使237nm处吸光度减少0.001的酶量为1U)。