Size:50T | 100T
存储:室温(15℃-25℃) 干燥保存,复检期 12 个月,2℃-8℃保存时间更长。
产品简介
真菌是具有真核和细胞壁的异养生物,种属很多,已报道的属达 1 万以上,种超过 10 万个。真菌通常又分为三类,即酵母菌、霉菌和蕈菌(大型真菌)。对于酵母菌和霉菌,可以用玻璃珠处理,而对于大型真菌,可直接用液氮研磨。经过前期处理的菌液,用硅质膜吸附,即可得到高纯度的基因组。提取纯化后的 DNA,可以直接用于PCR/Real time-PCR,sequencing,Southern blot,mutant analysis,SNP 等下游应用实验。
产品组分
操作步骤:
使用前请先在漂洗液中加入无水乙醇,加入体积请参照瓶体上的标签。所有离心步骤均为使用台式离心机在室温下离心。
1、样品的处理:
1)对于酵母菌,取 1-2ml 培养好的菌液,离心收集,弃上清。加入 200ul 溶液 A,加入 20ul RNase A,再加入 100mg 玻璃珠,在高速振荡器上振荡,约 5-10min。
2)霉菌(孢子也可相同处理):取 50-100mg 菌丝,加 200ul 溶液 A,用玻璃研磨器适当研磨分散菌丝,加入20ul RNase A,再加入 100mg 玻璃珠,在高速振荡器上振荡,约 30min。
3)大型真菌(如蘑菇等):称取 50-100mg 样品,倒入适量的液氮,立即研磨重复 3 次,使样品研成粉末(如无液氮,可加 200ul 溶液 A 后用玻璃研磨器适当研磨),加 200ul 溶液 A,加入 20ul RNase A,再加入 100mg 玻璃珠,在高速振荡器上振荡,约 5min。
2、加入 20ul 的蛋白酶 K(10mg/ml),充分混匀,55℃水浴消化 30min,消化期间可颠倒离心管混匀数次。12000rpm离心 2min。将上清转移到一个新的离心管中。如有沉淀,可再次离心。
3、在上清中加入 200ul 溶液 B,充分混匀。如出现白色沉淀,可放 55℃水浴 5min,沉淀即会消失,不影响后续实验。如溶液未变清亮,说明样品消化不彻底,可能导致提取的 DNA 量少及不纯,还有可能导致上柱后堵柱子,请增加消化时间。
4、再加入 200ul 无水乙醇,充分混匀,此时可能会出现絮状沉淀,不影响 DNA 的提取,将溶液和絮状沉淀都加入吸附柱中,放置 2 分钟。
5、12000rpm 离心 1min,弃废液,将吸附柱放入收集管中。
6、向吸附柱中加入 600ul 漂洗液(使用前请先检查是否已加入无水乙醇),12000rpm 离心 1min,弃废液,将吸附柱放入收集管中。
7、向吸附柱中加入 600ul 漂洗液,12000rpm 离心 1min,弃废液,将吸附柱放入收集管中。
8、12000rpm 离心 2min,将吸附柱置于室温或 50℃温箱放置数分钟,目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除,否则漂洗液中的乙醇会影响后续的实验如酶切、PCR 等。
9、将吸附柱放入一个干净的离心管中,向吸附膜中央悬空滴加 50-200ul 经 65℃水浴预热的洗脱液,室温放置 5min,12000rpm 离心 1min。
10、离心所得洗脱液再加入吸附柱中,室温放置 2min,12000rpm 离心 2min,即可得到高质量的基因组 DNA。
注意事项:
1. 由于真菌种类万千,对于一些特别难处理的真菌,可用液氮研磨,再用玻璃珠振荡,蛋白酶 K 处理,一般都可以得到一定量的基因组 DNA,如电泳检测很弱,一般 PCR 都会有较好结果。
2. 若溶液 A 或溶液 B 中有沉淀,可在 55℃水浴中重新溶解。
3. 如果 DNA 提取量很少,可加长玻璃珠处理时间,如果提取 DNA 成弥散短条带,可减少玻璃珠处理时间。
4. 洗脱缓冲液的体积不少于 50ul,体积过小会影响回收效率;洗脱液的 pH 值对洗脱效率也有影响,若需要用水做洗脱液应保证其 pH 值在 8.0 左右(可用 NaOH 将水的 pH 值调至此范围),pH 值低于 7.0 会降低洗脱效率;DNA 产物应保存在-20℃,以防 DNA 降解。
5. DNA 浓度及纯度检测:得到的基因组 DNA 片段的大小与样品保存时间、操作过程中的剪切力等因素有关。回收得到的 DNA 片段可用琼脂糖
凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。DNA 应在 OD260处有显著吸收峰,OD260 值为 1 相当于大约 50 μg/ml 双链 DNA、40 μg/ml 单链 DNA。OD260/OD280 比值应为 1.7-1.9,如果洗脱时不使用洗脱缓冲液,而使用去离子水,比值会偏低,因为 pH 值和离子存在会影响光吸收值,但并不表示纯度低。
6. 在确保样品无误的情况下,如经过多次试验,都无法提出 DNA,请将部分样品寄至我公司,我们代为摸索优
化条件,以使您的实验能够正常进行下去。
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