真菌基因组DNA提取试剂盒

真菌基因组DNA提取试剂盒（目录号：RTG2407）

● 试剂盒内容及保存：

● 储存条件和效期：

室温保存，24个月内有效。Buffer C2于Buffer C3可能有沉淀产生，37℃水浴溶解后即可。RNase A常温运输,-20℃保存。

● 产品简介：

该试剂盒采用简便的硅胶柱结合纯化方式和独特的溶液处理系统，可在60分钟内可处理多个100mg新鲜或30mg干燥真菌组织样品。独特的缓冲液与硅胶柱可以有效的去除组织裂解物种的多糖，酚类，以及酶抑制物。该试剂盒提取到的DNA可以用于PCR，Southern杂交，酶切消化等实验。无需使用酚氯仿等有机，可以同时进行多个样品的处理。

● 准备工作：

1. 准备65℃水浴；无水乙醇；异丙醇；制冰机；1.5ml离心管；2ml离心管

2. 按照标签所示在漂洗缓冲液PW中加入无水乙醇，混匀后盖紧瓶盖后室温贮存备用。

3. 每次使用前请检查缓冲液R2，缓冲液R3是否有沉淀生成，如果出现沉淀，37℃温浴至沉淀溶解后再使用。

● 标准操作步骤：

如非指出，所有离心步骤均为使用台式离心机在室温下离心。

1.样品的处理：

A．新鲜样品：新鲜样品可以用液氮研磨成粉末。或者在45℃烘箱下过夜来干燥后按干燥样品进行操作。

B．干燥样品：用研钵或研磨研杵研磨成粉末。

2. 小于100mg新鲜样品或者小于20mg干燥样品，加入600μl Buffer C1及4μl RNase A涡旋混匀。

3.65℃水浴10分钟。孵育过程中短暂涡旋管子几次。 

4. 加入150μl Buffer C2，颠倒振荡混匀,冰上放置1分钟后10,000×g下离心3min。 （离心后应分层，如还有漂浮物，请延长离心时间）。

5. 小心地把上清液吸至另一新的小离心管中。注意确保不要打散沉淀团或把组织碎片也一起转移。

6. 加入二分之一上清体积的 Buffer C3与与等体积的无水乙醇，充分混匀。如：向300μl 上清中加入150μl Buffer C3与300μl无水乙醇。 

7. 把上述混匀的液体转移到分离柱上。10,000×g离心1 min以结合DNA，弃去滤出液体。纯化柱容量为750μl,如果混合液大于750μl,请分两次过柱。 

8. 将GBC吸附柱重新套回收集管中，加入600μl DNA Wash Buffer（使用前须按要求用无水乙醇稀释）至柱子中，10,000×g离心1min,倒弃流出液；

9.再加入600μl DNA Wash Buffer至柱子中，8,000×g离心1min,弃去流出液；

10. 将吸附柱重新套回2ml收集管中，转速（>13.000xg）离心空结合柱1min以干燥柱子的基质；这一步对下面的洗脱步骤至关重要。 

12. 将柱子置于1.5ml灭菌离心管，加入50-150μl65℃预热的T洗脱缓冲液EB至柱子的膜中央。室温静置5min； 

13.  室温下，离心(>13000g)1min，以洗脱DNA。保留含DNA的流出液。将DNA储于-20℃。

对低DNA含量的样品按如下操作：

1. 收集研磨成粉末的植物组织，新鲜组织约400mg（干燥组织约200mg），置样品于15ml离心管中。

2. 加入9ml Buffer C1，剧烈地漩涡振荡。

3.65℃水浴30-60min。水浴期间颠倒样品数次。

4. 加入2.5ml Buffer C2，充分混匀，3000×g离心10分钟。转移上清到新的15ml离心管中，加入0.7倍的异丙醇，3000×g离心10分钟。

5. 倒掉上清，加入300μl的灭菌去离子水与5μl RNaseA。65℃水浴溶解DNA。

6. DNA完全溶解后，加入150μl Buffer C3与300μl无水乙醇。

7. 按标准操作步骤的第七步，继续往下操作。

● DNA浓度及纯度检测：

基因组DNA片段的大小与样品保存时间、操作过程中的剪切力等因素有关。提取的DNA片段可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。可配制0.8-1.0％琼脂糖凝胶，使用λ/HindIII判断基因组的大小，完整的基因组大小应在23kb以上。使用分光光度计检测时， OD₂₆₀/OD₂₈₀比值应为1.7–1.9之间，如果洗脱时不使用洗脱缓冲液，而使用去离子水洗脱，比值可能偏低，但并不表明DNA纯度不高。