小鼠成骨细胞

方法简介  实验室分离的小鼠成骨细胞采用先用胰蛋白酶短时间消化、后用胶原酶反复消化制备而来。

质量检测  实验室分离的小鼠成骨细胞经ALP染色检测，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

培养基：  小鼠成骨细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 梭形、多角形

传代比例： 1:2

传代特性： 可传3代左右

消化液： 0.25%胰蛋白酶

小鼠成骨细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：C57BL/6小鼠，取胫骨/股骨/关节软骨等组织

试剂：0.25%胰蛋白酶、II型胶原酶、DNase I、DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液、DMEM/F12培养基、FBS、PBS

分离纯化步骤

取实验动物目标骨组织或软骨组织，仔细去除软组织包膜

骨组织：剪碎后用0.25%胰蛋白酶消化20分钟，再加入II型胶原酶消化60-90分钟

软骨组织：剪碎后直接用II型胶原酶37度振荡消化4-6小时

消化液经70um和40um滤网过滤，400g离心10分钟收集细胞

原代培养要点

成骨细胞：使用DMEM+10%FBS培养基，37度、5% CO2培养，细胞呈多角形贴壁

软骨细胞：使用DMEM/F12+10%FBS+10ng/mL TGF-beta3培养基，可悬浮或三维培养

成骨细胞培养14-21天后可检测到ALP活性和矿化结节形成

软骨细胞传代后易去分化，建议采用低传代次数(2-3代)或三维球状培养维持表型

常见问题优化

骨细胞得率低：延长胶原酶消化时间至90分钟，或采用两次消化法

软骨细胞去分化：采用高浓度悬浮培养(1x10^5 cells/mL)维持软骨表型

成骨细胞污染：采用差速贴壁法或免疫磁珠分选提高成骨细胞纯度

细胞复苏：取出冻存管，37℃水浴快速融化冻存液，剩余少量冰晶取出，酒精擦拭外壁，转移至超净台。

细胞转移：将冻存管内细胞悬液转移至装有成骨细胞完全培养基的 15mL 离心管，轻柔颠倒混匀，稀释冻存保护剂。

离心洗涤：1000r/min 离心 5min，离心完成，弃除上层上清液，保留管底细胞沉淀。

重悬细胞：加入预热小鼠成骨细胞完全培养基，缓慢吹打沉淀，打散细胞团，制备均一细胞悬液。

接种铺板：细胞计数后按标准密度接种，十字晃动培养瓶，使细胞均匀铺展。

恒温孵育：放入 37℃、5% CO₂细胞培养箱静置孵育 24h，不要挪动培养容器，保证细胞贴壁。

换液观察：24h 后更换新鲜培养基，后续每 2‑3 天换液，观察多边形成骨细胞形态，汇合度 80%‑85% 可传代，诱导矿化实验可添加成骨诱导培养基。