大鼠神经少突胶质前体细胞

方法简介  实验室分离的大鼠神经少突胶质细胞采用胰蛋白酶消化、混合细胞营养缺失培养、摇床振荡结合差速贴壁法并通过专用培养基培养筛选制备而来。

质量检测  实验室分离的大鼠神经少突胶质前体细胞经A2B5免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

包被条件： PLL（0.1 mg/mL）

培养基： 大鼠神经少突胶质前体细胞完全培养基(含B-27、PDGF、bFGF、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 双极、多极形

传代比例： 不传代

传代特性： 不传代，不增殖，存活1-2周

消化液： 0.25%胰蛋白酶

大鼠神经少突胶质前体细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：SD大鼠，取脑组织或脊髓组织

试剂：0.25%胰蛋白酶、II型胶原酶、DNase I、DMEM/F12培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液、DMEM/F12培养基、FBS、EGF、FGF-b、PDGF-AA

分离纯化步骤

取实验动物脑组织或脊髓组织，用预冷PBS冲洗去除血液

去除脑膜和血管组织，将目标区域剪碎至1mm3

用0.25%胰蛋白酶消化20分钟，再加入II型胶原酶消化30分钟

过滤后300g离心8分钟收集细胞，重悬于含EGF和FGF-b的培养基中

采用磁珠分选或差速培养法富集目标胶质细胞类型

原代培养要点

胶质细胞(星形胶质细胞/少突胶质细胞/小胶质细胞)培养条件略有差异

星形胶质细胞：DMEM/F12+10%FBS，37度、5% CO2，细胞呈多角形贴壁生长

少突胶质细胞：需PDGF-AA维持增殖，分化期添加T3、甲状腺素促进成熟

小胶质细胞：采用振荡分选法从混合胶质细胞中分离，悬浮或弱贴壁生长

常见问题优化

胶质细胞交叉污染：采用免疫磁珠分选可提高纯度至90%以上

少突胶质细胞分化率低：添加C57条件培养基或IBMX可促进少突胶质细胞成熟

小胶质细胞活化：避免过度培养，原代培养5代以内保持静息态表型

实验准备：配制少突胶质前体细胞专用培养基，准备无菌精细器械、预冷缓冲液，选取新生大鼠大脑白质组织。

无菌取材：无菌剥离大鼠大脑白质区域，剔除灰质、血管及脑膜组织，冰上缓冲液漂洗去污。

组织处理：剪碎白质组织，轻柔分散组织块，富集少突胶质前体细胞组分。

酶解消化：低浓度胰酶37℃温和消化18min，间断轻柔吹打，解离前体细胞。

纯化离心：培养基终止消化，梯度离心纯化，1200rpm离心5min，富集前体细胞沉淀。

接种培养：专用培养基重悬接种，恒温培养箱静置培养，促进前体细胞增殖。

常规养护：每2天换液一次，严格控制培养条件，维持前体细胞未分化状态，可诱导成熟分化。