L半乳糖酸1,4内酯脱氢酶(Gal LDH)测试盒

商品属性：

商品介绍：

L-半乳糖途径是合成AsA的主要途径。Gal LDH位于线粒体内膜，负责催化植物体内AsA生物合成的最后一步，也是该途径的关键酶之一，对植物体内AsA含量的积累起着至关重要的作用。

测定原理：

Gal LDH催化L-半乳糖内酯还原细胞色素C(Cyt c)，还原型Cyt c在550nm有吸收峰；测定还原型Cyt c增加速率，来计算Gal LDH活性。

自备仪器和用品：

台式离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水。
检测原理：

酶促氧化底物原理：Gal‑LDH 催化底物 L‑半乳糖酸‑1,4‑内酯发生脱氢氧化反应，生成 L‑抗坏血酸 (维生素 C)；同时将电子传递给氧化型辅酶，辅酶被还原。

辅酶还原显色 / 分光信号原理：常用 NAD⁺作为电子受体，反应后生成 NADH；NADH 在 340 nm 紫外波长有特征吸收峰。

速率动力学检测原理：连续监测 340 nm 处吸光度随时间上升速率；吸光度上升速率与酶活性成正比。

对照基线校正原理：设置不加底物空白管，扣除样品中内源 NADH 变化干扰；以每分钟 NADH 生成量计算酶活力。
样本前处理方法：

‌一、组织样本‌

离体后立即液氮速冻，取0.1g新鲜组织按1:10比例加入预冷提取液。

冰浴条件下充分匀浆，超声破碎30次（功率20%，超声3s/间隔10s）。

8000g 4℃离心10min，取澄清上清置于冰上待测。

‌二、细胞/细菌样本‌

收集500万~1000万细胞，弃去培养基后加入1mL预冷提取液。

冰浴超声破碎，8000g 4℃离心10min，取上清待测。

三、液体样本‌

血清/血浆样本按1:10比例加入提取液，沸水浴振荡提取10min。

10000g常温离心10min，取上清冷却后待测。

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测定操作步骤：

操作仪器预热：将可见分光光度计预热30min，调节波长至540nm，用蒸馏水调零标准曲线绘制：

取6支具塞刻度试管，分别加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL葡萄糖标准液（10mg/mL）

用蒸馏水补至1.0mL，再加入2.0mL显色工作液，沸水浴5min

立即用流水冷却至室温，定容至25mL，摇匀后测定540nm处吸光值

以葡萄糖浓度（mg/mL）为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线样本测定：

试剂名称(μL) 空白管 测定管

提取液/样本 100 100

试剂一 700 700

试剂二 100 100

混匀后37℃水浴30min，立即加入2.0mL显色工作液，沸水浴5min

流水冷却至室温，定容至25mL，摇匀后测定540nm处吸光值A空白和A测定