L半乳糖酸1,4内酯脱氢酶(Gal LDH)测试盒

商品属性

测定意义与原理

测定意义

Gal LDH是定位于线粒体内膜的关键酶，负责催化植物体内抗坏血酸（AsA）生物合成的最后一步，对植物体内AsA含量的积累起着至关重要的作用。AsA是植物体内重要的抗氧化剂，参与多种生理过程，包括：抗氧化防御：清除活性氧，保护细胞免受氧化损伤光合作用：参与光合电子传递，调节光合效率细胞伸长：调节细胞壁代谢，促进细胞生长信号转导：作为信号分子，参与激素调节和胁迫响应

测定原理

Gal LDH催化L-半乳糖内酯氧化，同时还原细胞色素C（Cyt c），还原型Cyt c在550nm有特征吸收峰，通过测定还原型Cyt c增加速率，计算Gal LDH活性。反应式如下： L-半乳糖内酯+Cyt c(氧化型)→Gal LDHAsA+Cyt c(还原型)L-半乳糖内酯+Cyt c(氧化型)Gal LDHAsA+Cyt c(还原型)

试剂盒组成

组分 规格 作用说明

试剂一 50mL×1瓶/100mL×1瓶 含0.1mol/L Tris-HCl缓冲液，pH8.0，用于反应体系构建

试剂二 10mL×1瓶/20mL×1瓶 含0.5mmol/L细胞色素C，电子受体

试剂三 10mL×1瓶/20mL×1瓶 含10mmol/L L-半乳糖内酯，反应底物

试剂四 5mL×1瓶/10mL×1瓶 含0.1mol/L EDTA，金属离子螯合剂

标准品 1×100U 用于校准仪器，建立标准曲线

提取液 100mL×1瓶 含0.1mol/L Tris-HCl缓冲液，pH7.4，用于样本提取

自备仪器与试剂

必备仪器

可见分光光度计/酶标仪（550nm检测通道）

低温离心机（≥8000g）

恒温水浴锅（控温精度±0.5℃）

可调式移液器（0.5-10μL、10-100μL、100-1000μL）

研钵/组织匀浆器（冰浴专用）

必备耗材

1mL玻璃比色皿/96孔板

离心管（1.5mL、10mL）

一次性无菌吸头

手术剪/镊子（用于组织样本处理）

自备试剂

蒸馏水/去离子水

生理盐水（0.85% NaCl）

抗凝剂（肝素/EDTA，仅用于血浆样本）

样本前处理方法

动植物组织样本取新鲜组织，用生理盐水冲洗干净，滤纸吸干水分称取约0.1g组织，加入1mL预冷提取液，冰浴匀浆8000g 4℃离心10min，取上清液置冰上待测若酶活性过高，可用提取液稀释1-5倍后测定

细菌/细胞样本收集对数生长期细菌/细胞，8000g 4℃离心5min弃上清按照细菌或细胞数量(10⁴个):提取液体积(mL)=500~1000:1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率20%或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）8000g 4℃离心10min，取上清液置冰上待测

血清/血浆样本血清样本：血液凝固后3000g 4℃离心10min，取血清上清血浆样本：加入抗凝剂（肝素/EDTA）后3000g 4℃离心10min，取上清样本可直接检测，无需提取处理；活性过高时可用生理盐水稀释

测定操作步骤

可见分光光度法操作

试剂准备：

试剂一：0.1mol/L Tris-HCl缓冲液，pH8.0，4℃保存

试剂二：0.5mmol/L细胞色素C溶液，-20℃避光保存

试剂三：10mmol/L L-半乳糖内酯溶液，-20℃避光保存

试剂四：0.1mol/L EDTA溶液，4℃保存

工作液：试剂一 + 试剂二 + 试剂三 + 试剂四，按体积比100:5:5:2混合，现配现用

预温育：

分光光度计预热30min，调节波长到550nm，用蒸馏水调零

工作液在37℃（哺乳动物）或25℃（植物）水浴中预热10min以上

反应启动：

取比色皿，依次加入：工作液950μL + 样本50μL

混匀，记录550nm波长下0min（A1）和1min（A2）时的吸光度值

计算ΔA：ΔA = A2 - A1

酶活性计算：

根据ΔA值，按照公式计算Gal LDH活性

微量法（酶标仪）操作96孔板每孔加入：工作液95μL + 样本5μL37℃预温育5min，加入样本后立即混匀设置动力学模式，550nm处连续读取10个循环（每1min读取1次）计算吸光度增加速率（ΔA/min）

酶活力计算方法

单位定义

U/g鲜重：每g组织鲜重每分钟催化1μmol底物反应的酶量

U/mL：每mL样本每分钟催化1μmol底物反应的酶量

U/mgprot：每mg蛋白每分钟催化1μmol底物反应的酶量

计算公式

Gal LDH活性(U/mgprot)=ΔA×V反总×V样总ε×d×Cpr×V样测×TGal LDH活性(U/mgprot)=ε×d×Cpr×V样测×TΔA×V反总×V样总

ΔA：1min内吸光度变化值

V反总：反应体系总体积（1.0mL）

V样总：样本提取液总体积（mL）

ε：还原型细胞色素C摩尔消光系数（2.1×10⁴ L/(mol·cm)）

d：比色皿光径（1cm）

Cpr：样本蛋白浓度（mg/mL）

V样测：测定时加入样本体积（0.05mL）

T：反应时间（1min）

简化公式

组织样本：Gal LDH（U/g鲜重）= 0.238 × ΔA ÷ W

液体样本：Gal LDH（U/mL）= 0.238 × ΔA

蛋白样本：Gal LDH（U/mgprot）= 0.238 × ΔA ÷ Cpr

性能指标

指标 要求

线性范围 0~100U/mL，线性相关系数r≥0.995

最低检测限 ≤0.5U/mL

回收率 90%~110%

批内精密度 CV≤5.0%

批间精密度 CV≤8.0%

稳定性 4℃保存12个月，活性保留≥90%

注意事项

样本处理：

样本需新鲜制备，避免酶失活；-80℃可保存1个月

匀浆与超声破碎需在冰浴中进行，控制温度在0-4℃

样本需避免氧化，处理过程中尽量减少与空气接触

试剂使用：

L-半乳糖内酯溶液对光敏感，配制后需避光保存

细胞色素C溶液需现配现用，避免氧化

不同批号试剂不能混用，需重新绘制标准曲线

测定过程：

反应温度需严格控制在37℃（哺乳动物）或25℃（植物）

若ΔA值大于0.3，需稀释样本后重新测定

每个样本需设置平行实验，结果取平均值

质量控制：

每次实验需设置空白对照和质控样本

定期校准仪器，确保检测结果准确性

若结果偏差较大，需检查试剂是否变质或样本处理是否正确

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