肽N-糖苷酶

1. 在变性条件下进行SDS-PAGE的蛋白质去糖基化
(1) 在水中加入50μg目标糖蛋白（或低离子强度的相容缓冲液）至最终体积为12μl。
(2) 加入1μl 的5％SDS。
(3) 加入1μl的 1MDTT。
(4) 在95℃加热5min使样品变性。
(5) 在室温下冷却5min。
(6) 加入2μl的0.5M磷酸钠缓冲液（pH 7.5）。如果pH在PNGase F（pH 6-10）范围内，可以使用其他缓冲液。   
(7) 加入2μl的10％NP-40。可用Triton X-100替代NP-40。
(8) 加入2μl的PNGase F.
(9) 在37°C孵育1-3h。
注意：糖蛋白的去糖基化可以通过SDS-PAGE上的凝胶移位来观察，去糖基化的产物比糖基化的底物移动的更快。
 
2.  在非变性条件下进行质谱检测的蛋白质去糖基化
(1) 在50mM碳酸氢铵（pH 7.8）中加入20μg的糖蛋白至终体积为18μl。
(2) 加入2μl的PNGase F.
(3) 在37°C孵育2-18h。
注意：在变性条件下大多数底物能够更好的去糖基化，在非变性条件下可能需要增加PNGase F的量和延长孵育时间。