HES（Human Embryonic Skin fibroblasts）为人胚胎皮肤来源的成纤维样细胞，贴壁生长，呈典型长梭形，汇合时常呈“鱼群状/漩涡状”排列，核型为正常二倍体，增殖能力较强，体外倍增时间约24-30h。该细胞可分泌Ⅰ/Ⅲ型胶原、弹性蛋白及基质金属蛋白酶（MMPs）等细胞外基质成分与调控因子，较好地保留了皮肤成纤维细胞的生物学功能，广泛应用于皮肤发育与创伤修复、瘢痕形成机制、炎症因子分泌、生物材料相容性评价及基因转染宿主等研究。作为正常二倍体细胞，HES不具备无限传代能力，建议使用低代次细胞开展实验，且对消化过度与低血清条件较为敏感，培养中需严格控制胰酶消化时间、保证血清质量，以维持细胞良好的增殖状态与表型稳定。本文将针对HES的细胞培养流程进行梳理和指导。
一、细胞复苏
1.【准备工作】配制完全培养基：DMEM高糖（abs9483-500ml/SV30303.01）+10%FBS（abs972-500mL/SV30302.03）+1%P/S（abs9244-100ml/SV30010），取9mL完全培养基于37℃预热。水浴锅预热至37℃；生物安全柜紫外照射30min。
2.【融化】从液氮/冰箱取出冻存管，37℃水浴快速摇晃融化，约1-2min。
3.【重悬】75%酒精擦拭冻存管外壁，安全柜内开盖，将细胞悬液沿管壁缓慢滴入含7-9mL预热完全培养基的离心管中，避免直接冲击，轻柔混匀。
4.【离心】300×g离心5min，弃上清，去除DMSO残留。
5.【重悬】加入1-2mL完全培养基轻轻吹打重悬；接种T25培养瓶（加入5-6mL完全培养基），十字混匀，标注名称、代次、日期。
6.【培养】放入37℃、5%CO₂培养箱静置培养；次日换液，去除死细胞碎片与残留DMSO。
二、细胞传代
1.【实验准备】配制完全培养基：DMEM高糖（abs9483-500ml/SV30303.01）+10%FBS（abs972-500mL/SV30302.03）+1%P/S（abs9244-100ml/SV30010）。提前取出PBS（abs962-500ml/SV30305.01）、完全培养基、0.25%胰酶-EDTA（abs47047375-100mL/SH30042.01），恢复至室温；生物安全柜提前使用紫外照射30min。
注意：成纤维细胞对血清批次较敏感，建议固定批号并使用优级胎牛血清（abs972-500mL/SV30302.03）；如开展低血清适应实验，可逐步将血清浓度降至5%，切勿骤然降低。
2.【镜检】融合度达80%时传代，细胞呈长梭形、铺展饱满即可操作；过度融合会降低活力并加速老化。
3.【细胞清洗】吸弃旧培养基，沿瓶壁缓慢加入2-3mL PBS（abs962-500ml/SV30305.01），轻摇覆盖，吸弃。
4.【细胞消化】加入0.25%胰酶-EDTA（abs47047375-100mL/SH30042.01）覆盖瓶底，37℃消化2-3min，镜下见60%-70%细胞变圆、回缩即加完全培养基终止（培养基:胰酶≈2:1）。
注意：HES为正常二倍体细胞，胰酶消化时间不宜超过3min，过度消化易造成细胞损伤与功能（如胶原分泌能力）丢失。
5.【离心】300×g离心5min，弃上清；加入完全培养基轻轻吹打5-10次重悬。
6.【传代】按1:2-1:4接种至新瓶，补加完全培养基至工作体积，十字混匀，标注信息。
7.【镜检】镜下确认分散均匀，放入37℃、5%CO₂培养箱，24-48h观察细胞状态。
注意：低代次细胞增殖与分泌功能最佳，建议使用≤P10代内细胞，高代次易出现老化（体积增大、增殖变慢）。
三、细胞冻存
1.【准备工作】冻存液：无血清细胞冻存液（abs9417-100mL）或90% FBS（abs972-500mL/SV30302.03）+10% DMSO（abs9187-100mL），现用现配；冻存管标注名称、代次、冻存人、日期；安全柜紫外照射30min。
2.【细胞收集】融合度80%时按传代步骤消化收集，300×g离心后弃上清。
3.【细胞重悬】加入冻存液（约1mL/管）轻柔吹打重悬，细胞密度约1-5×10⁶/mL。
4.【冻存】每管1mL入冻存盒，-80℃过夜后转移至液氮罐长期保存；建议尽早冻存低代次（≤P10）细胞作为种子库。
四、关键注意事项
1.密度与消化
（1）融合度80%传代，过度融合加速老化、活力下降；
（2）胰酶消化2-3min，不超过3min，镜下60%-70%变圆即终止；
（3）接种密度不宜过低，传代比1:2-1:4，过低增殖缓慢。
2.血清与功能维持
（1）血清质量与批次直接影响增殖、贴壁及胶原分泌，建议固定批号；
（2）长期低血清培养需逐步适应（10%→5%），避免骤降导致生长停滞；
（3）功能实验（如胶原合成检测）可补加50μg/mL抗坏血酸以提升胶原分泌；
3.形态与污染判断
（1）正常：长梭形成纤维样、贴壁展开、鱼群状或漩涡状排列；
（2）异常：胞体增大扁平、颗粒增多、生长停滞（老化）；培养基浑浊（污染）。
4.支原体与鉴定
（1）作为正常二倍体细胞，建议每2-3代以PCR或荧光染色法检测支原体；
（2）建议以STR鉴定确认细胞身份，避免与其他成纤维细胞交叉污染。
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