CRM197结合疫苗载体选型：白喉毒素、白喉类毒素与无毒突变体机制差异

摘要：白喉毒素、白喉类毒素与 CRM197 同源于相同蛋白骨架，但脱毒方式截然不同。本文拆解三者的结构、毒性机制与分子特性，分析其在偶联位点、均一性、抗载体抗体等方面的差异，为结合疫苗载体选型提供参考。

关键词：CRM197、白喉毒素无毒突变体、白喉毒素、白喉类毒素、CRM197 蛋白、结合疫苗载体、疫苗开发、多糖偶联、ADP 核糖基化、抗载体抗体、载体蛋白

在结合疫苗研发与生产场景中，白喉毒素、白喉类毒素、CRM197（白喉毒素无毒突变体）三个术语常被混用。三者不仅名称相近，在毒力机制、脱毒方式、分子均一性、可用偶联位点等方面也存在明确差异，这些差异直接影响结合疫苗载体蛋白的选型与关键质量属性。本文梳理三者的分子结构、毒性机制与技术特点，为载体选型提供参考。

一、白喉毒素的分子结构与毒性机制

白喉毒素（diphtheria toxin，DT）由溶原化的白喉棒状杆菌分泌，编码毒素的 tox 基因位于 β 棒状杆菌噬菌体上，仅携带该噬菌体的菌株才可产生毒素。

图1.白喉毒素（diphtheria toxin，DT）虚拟示意图

成熟白喉毒素为单链蛋白，共 535 个氨基酸，分子量约 58 kDa，经蛋白酶酶切后，由二硫键连接形成 A、B 两个片段。其结构可分为三个功能域：

表1 白喉毒素的三个功能域

白喉毒素毒性作用遵循明确的细胞通路：

1. R 区结合细胞表面的 HB-EGF（肝素结合表皮生长因子样生长因子）受体；

2. 受体介导内吞，毒素进入细胞内体；

3. 内体酸化后 T 区插入膜并形成通道，催化片段（A 片段）转位至细胞质；

4. A 片段以 NAD⁺为底物，将 ADP-核糖基转移至延伸因子 eEF2 的特殊组氨酸残基（白喉酰胺，diphthamide）上；

5. 修饰后的 eEF2 失活，蛋白质合成受阻，最终细胞死亡。

该毒素毒性较强，文献记载人的致死剂量约为 0.1μg/kg 体重；体外实验显示，单个 A 片段分子进入胞质即可导致细胞死亡。

图2. 白喉酰胺（Diphthamide），一种翻译后修饰的组氨酸氨基酸

二、白喉类毒素：甲醛介导的化学脱毒

白喉类毒素（diphtheria toxoid）是较早的白喉脱毒产物，1923 年由巴斯德研究所报道：白喉毒素经甲醛处理并加热后，毒性降低，但仍保留抗原性，可诱导机体产生中和抗体。该技术也是后续白喉疫苗、百白破联合疫苗的基础。

（一）脱毒原理

甲醛可与蛋白质侧链的氨基（特别是赖氨酸残基）发生反应，形成分子内及分子间交联，通过封闭或改变酶活性位点的空间构象，使毒素丧失酶活性与毒性。

（二）技术特点

化学脱毒属于非定点修饰，产物存在以下固有特点：

1. 分子异质性较高：产物为多种不同修饰产物的混合物，纯度通常在 60%~70%区间，批间差异相对较大；

2. 部分表位受影响：交联与修饰可能覆盖或改变部分 T 细胞、B 细胞表位；

3. 可用偶联位点减少：赖氨酸的氨基既是甲醛的主要作用位点，也是多糖偶联的常用位点，二者存在竞争；

4. 存在回复毒性风险：稀释或去除游离甲醛后，存在部分毒性回复的可能，工艺中通常需加入赖氨酸等物质抑制回复，同时需控制游离甲醛残留量。

作为疫苗抗原，白喉类毒素可满足常规免疫需求；但作为结合疫苗载体时，上述特点会直接影响偶联工艺与产品质量控制。

三、CRM197：基因点突变实现毒性丧失

CRM（cross-reacting material，交叉反应物质）是通过诱变筛选得到的无毒性白喉毒素突变蛋白，可与白喉毒素抗体发生免疫交叉反应。该系列包含 CRM30、CRM45、CRM197 等多个突变体，其中 CRM197（点击查看）因结构与野生型毒素差异较小、仅丧失酶活性，成为应用较多的结合疫苗载体。

（一）分子基础

CRM197 与野生型白喉毒素仅相差 1 个氨基酸：第 52 位甘氨酸突变为谷氨酸（G52E），对应 tox 基因上一个 G→A 的单碱基突变。

2012 年晶体结构研究阐明了其毒性丧失的机制：CRM197 的整体折叠与野生型毒素高度相似，但覆盖 NAD 结合口袋的活性位点环柔性增加，无法正常结合 NAD⁺，因此失去 ADP-核糖基转移酶活性，毒性随之丧失。

图3.CRM197 蛋白虚拟结构图

（二）相比化学脱毒的技术特点

由于毒性通过基因层面的单点突变消除，CRM197 具备以下特点：

1. 无需化学脱毒：无甲醛等脱毒试剂残留，不存在回复毒性的风险；

2. 分子均一性较好：结构明确单一，便于表征与批间质量控制；

3. 偶联位点完整：序列中全部 39 个赖氨酸残基保持游离状态，可用于多糖偶联；

4. 表位保留完整：无化学修饰与交联，T 细胞、B 细胞表位保存更完整；

5. 抗载体抗体水平较低：作为载体时，诱导的抗载体抗体水平低于白喉类毒素，对多糖抗原的免疫干扰相对更小。

四、三者差异与结合疫苗载体选型

结合疫苗的基本原理，是将细菌荚膜多糖（TI-2 型抗原，婴幼儿应答弱、免疫记忆差）与载体蛋白偶联，转化为胸腺依赖型（TD）抗原，从而诱导高亲和力 IgG 与记忆 B 细胞。

载体蛋白的选型需综合考虑以下维度：

表2. 白喉类毒素与 CRM197 作为结合疫苗载体的对比

关于抗载体抗体与载体诱导的表位抑制（CIES），需说明两点：

• 抗载体抗体水平低，不等于免疫原性弱。CRM197 保留了与天然毒素相当的抗原性与免疫原性；白喉类毒素因甲醛交联的“稳定化”作用，作为游离蛋白时免疫原更高。可能与甲醛交联改变抗原加工与表位呈现有关

• 由于含白喉类毒素的百白破疫苗属于常规免疫，人群普遍存在预存抗白喉抗体；而 CRM197 不作为单独免疫原使用，预存抗体水平更低，在偶联疫苗中“喧宾夺主”的风险相对更小。该结论已在部分临床与动物研究中观察到，但 CIES 的临床意义在学术界仍存讨论。

五、常见误区

（一）“CRM197 就是脱毒的白喉毒素”

不准确。白喉类毒素是甲醛化学脱毒产物，CRM197 是基因单点突变的无毒性蛋白，二者制备路径、产物均一性、试剂残留均不相同。

（二）“CRM197 没有免疫原性”

错误。CRM197 保留了天然毒素的抗原表位，具有明确的免疫原性，只是作为游离蛋白时免疫原性低于白喉类毒素，作为载体时诱导的抗载体抗体水平也较低

（三）“类毒素和 CRM197 可以互换使用”

不建议直接互换。二者脱毒方式、表位完整度、可用偶联位点、质量控制方法均存在差异，互换使用需重新评估偶联工艺、免疫原性及相关申报资料。

结语

白喉毒素、白喉类毒素与 CRM197 共享同一 535 个氨基酸的蛋白骨架，主要差异在于毒性的处理方式：

• 白喉毒素保留完整酶活性，具有细胞毒性；

• 白喉类毒素通过甲醛化学处理消除毒性，伴随分子异质性增加、偶联位点减少等变化；

• CRM197 通过基因单点突变消除酶活性，结构与功能位点保留更完整。

明确三者的机制差异，可更清晰地支撑结合疫苗载体选型、工艺开发与质量控制。

参考文献

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