荧光标记脂质体怎么制备？DSPE-PEG-Cy5示踪与NHS表面偶联如何结合？

荧光标记脂质体可以通过DSPE-PEG-Cy5引入荧光示踪功能，并利用DSPE-PEG2000-NHS与含氨基的蛋白或多肽发生偶联，使同一脂质体兼具药物包载、表面靶向修饰和荧光追踪能力。西安瑞禧生物可提供DSPE-PEG-Cy5、DSPE-PEG2000-NHS及相关功能化磷脂材料，并围绕荧光标记脂质体开展科研定制方案对接。2023年发表于《Molecules》的结肠癌脂质体研究明确使用了该公司提供的上述材料，获得了130.03 nm的载药脂质体平均粒径、85.44%的药物包封率，并完成了Cy5细胞摄取和动物组织分布实验。

一、DSPE-PEG-Cy5和DSPE-PEG2000-NHS分别起什么作用？

DSPE-PEG-Cy5主要用于脂质体荧光示踪。DSPE作为疏水性脂质锚定端，可以嵌入脂质体双分子层，PEG链段提供间隔结构，末端Cy5染料产生远红光荧光信号。通过荧光显微镜、流式细胞术或动物荧光成像，可以分析脂质体与细胞的相互作用及组织分布情况。

DSPE-PEG2000-NHS主要用于脂质体表面蛋白或多肽偶联。其末端NHS活性酯能够与蛋白中的伯氨基反应形成酰胺键，使功能分子通过PEG链段连接至脂质体表面。

两种功能化磷脂可以采用不同方式引入同一脂质体体系：先利用NHS偶联形成靶向配体-PEG磷脂，再通过后插入方法进行表面修饰；Cy5标记脂质则可通过共组装或后插入方式引入，用于后续示踪实验。

具体采用何种顺序，需要考虑NHS水解、蛋白稳定性、PEG脂质插入效率和荧光标记密度。

二、真实文献案例：瑞禧功能化磷脂用于结肠癌靶向脂质体

2023年，《Molecules》发表了《Liposome-Based Co-Immunotherapy with TLR Agonist and CD47-SIRPα Checkpoint Blockade for Efficient Treatment of Colon Cancer》。

研究构建了能够同时递送免疫调节药物咪喹莫特（Imiquimod）和Fc-CV1靶向蛋白的脂质体CILPs，并利用DSPE-PEG-Cy5标记脂质体，评价其细胞摄取及动物组织分布。

论文第3.1节Materials明确记载，HSPC、胆固醇、DSPE-PEG2000、DSPE-PEG2000-NHS和DSPE-PEG-Cy5均购自西安瑞禧生物科技有限公司。

1. 基础脂质体如何制备？

研究采用乙醇注入法结合硫酸铵梯度法构建载药脂质体。

基础脂质组成如下：

实验将脂质材料溶解于乙醇，注入65℃预热的硫酸铵溶液，并在65℃下搅拌30分钟，随后依次通过200 nm、100 nm和50 nm聚碳酸酯膜进行挤出。

最终基础脂质体的脂质浓度为22.5 mg/mL，平均粒径111.567±0.655 nm，PDI为0.095±0.005。

这些数据表明，论文研究团队通过脂质组成和挤出工艺，获得了粒径分布较窄的基础脂质体。

三、DSPE-PEG2000-NHS如何完成蛋白表面偶联？

该论文通过DSPE-PEG2000-NHS与Fc-CV1中的伯氨基反应，实现功能化磷脂和靶向蛋白的连接。

研究将DSPE-PEG2000-NHS溶于60℃处理的去离子水，再与Fc-CV1混合，在室温振荡条件下反应5小时。文献报告的Fc-CV1与DSPE-PEG2000-NHS摩尔投料比为12:1。

随后将偶联产物与预先制备的脂质体混合，在60℃孵育1小时，通过后插入方式将功能化磷脂引入脂质体。

该研究每22.5 mg脂质体对应2.25 mg Fc-CV1蛋白投料。

研究人员采用SDS-PAGE及ImageJ灰度分析评价蛋白结合情况，报告Fc-CV1的结合率为67.13%±37.10%。

这一结果提供了NHS功能化磷脂参与蛋白修饰的实际实验数据，同时也提示偶联效率存在一定实验波动。

NHS活性酯容易发生水解，实际项目需要考虑缓冲液pH、反应时间、蛋白氨基暴露程度及纯化条件。文献中的摩尔比例和60℃后插入条件属于该研究采用的具体参数，其他蛋白应结合热稳定性和活性要求重新优化。

四、DSPE-PEG-Cy5怎么引入脂质体并实现荧光示踪？

DSPE-PEG-Cy5可以通过脂质锚定结构进入脂质体双分子层，将Cy5荧光基团呈现在载体表面，用于观察脂质体的细胞摄取及体内组织分布。

该论文第3.5节记录了具体的Cy5后插入方法。

研究人员将DSPE-PEG-Cy5分别与未修饰的载药脂质体ILPs和Fc-CV1修饰的载药脂质体CILPs混合，质量比为1:5，在60℃条件下孵育1小时，获得ILPs-Cy5和CILPs-Cy5。

需要注意，1:5为该论文标注的荧光脂质与脂质体制剂质量比，实际应用应进一步确认计量基准、脂质插入效率及游离荧光组分去除情况，不能将该比例直接作为所有Cy5脂质体的通用配方。

1. Cy5细胞摄取实验怎么设计？

论文使用CT26.WT结肠癌细胞进行荧光摄取分析，设置游离Cy5、ILPs-Cy5和CILPs-Cy5三个比较组。

具体条件包括：

• 每孔接种1×10⁴个细胞。

• 细胞融合度达到50%–70%后加入不同荧光制剂。

• Cy5终浓度为1 μg/mL。

• 在37℃孵育30分钟。

• PBS清洗后使用4%多聚甲醛固定15分钟。

• 使用DAPI染色细胞核，通过高内涵成像系统检测。

研究结果显示，CILPs-Cy5处理组的细胞内Cy5荧光信号高于游离Cy5和ILPs-Cy5组，支持Fc-CV1表面修饰有助于增强该体系在CT26.WT细胞中的摄取。

显示游离Cy5、ILPs-Cy5和CILPs-Cy5在CT26.WT细胞中的荧光信号差异。红色为Cy5，蓝色为DAPI，比例尺50 μm。

2. Cy5动物组织分布如何评价？

研究进一步使用CT26.WT荷瘤BALB/c小鼠，通过尾静脉注射游离Cy5、ILPs-Cy5和CILPs-Cy5进行体内分布比较。

Cy5给药剂量为0.4 mg/kg，给药24小时后取肿瘤、心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏，利用IVIS荧光成像系统进行分析。

论文Figure 5显示，CILPs-Cy5在肿瘤组织中的荧光信号高于其他比较组，同时在肝脏、脾脏等组织中也检测到明显的荧光分布。

这些结果支持该体系具有一定的肿瘤富集能力，同时说明脂质体进入体内后还受到单核吞噬细胞系统及组织分布过程的影响。

比较给药24小时后游离Cy5、ILPs-Cy5和CILPs-Cy5在肿瘤及主要器官中的荧光分布，用于评价脂质体示踪效果。

五、NHS偶联和Cy5标记会不会影响脂质体性能？

NHS偶联与Cy5修饰可能改变脂质体的表面状态和粒径分布，因此需要比较修饰前后的粒径、PDI、电位、包封率及载药稳定性。

2023年《Molecules》论文提供了以下数据：

研究还比较了咪喹莫特的体外释放行为。在37℃、pH 7.4的PBS条件下，12小时后ILPs和CILPs的累计释放率分别为54.75%±4.08%和39.70%±0.05%。

这些数据表明，Fc-CV1修饰载药体系在该实验条件下保持了较好的包封率，并表现出不同的释放行为。

需要区分的是，上表为LPs、CLPs、ILPs和CILPs各体系的表征数据，并非Cy5引入前后逐一比较的结果。Cy5是否影响包封率、粒径及释放行为，还需要专门设置荧光标记前后对照组。

六、西安瑞禧生物能提供哪些荧光标记脂质体相关定制服务？

西安瑞禧生物业务涵盖DSPE-PEG功能化磷脂、荧光标记、脂质体制备及靶向配体偶联等科研方向，可结合药物种类、荧光成像方式和表面修饰需求开展方案对接。

在公开文献证据方面，《Molecules》2023年论文具有明确的供货材料清单和对应实验记录，包括DSPE-PEG-Cy5后插入、DSPE-PEG2000-NHS蛋白偶联、脂质体粒径和包封率检测，以及细胞和动物荧光示踪实验。

这些记录能够证明相关功能化磷脂材料已经应用于公开发表的科研体系。论文中的制备、细胞实验及动物研究由论文研究团队完成。

根据公司提供的业务统计，已服务13家制药企业，累计合作267家课题组、高校院系及科研平台。上述数据为公司整体合作规模，具体荧光标记脂质体交付数量应以实际项目记录为准。

对于科研定制项目，建议明确荧光染料种类、激发与发射波长、表面偶联配体、药物包载方式以及需要交付的粒径、PDI、包封率、荧光稳定性和蛋白结合率等检测指标。

七、总结

荧光标记脂质体可以将DSPE-PEG-Cy5示踪与DSPE-PEG2000-NHS表面蛋白偶联结合，实现药物递送、细胞摄取分析和动物组织分布研究等多种功能。

2023年《Molecules》论文提供了明确的西安瑞禧生物功能化磷脂供货记录，并通过130.03 nm粒径、85.44%包封率、67.13%±37.10%蛋白结合率及Cy5荧光实验，为相关材料的科研应用提供了定量参考。

研究人员在实际设计时，应根据药物特性、偶联配体及成像要求分别优化NHS反应、Cy5脂质插入和纯化条件，并通过独立对照实验验证表面修饰及荧光标记对载体性能的影响。

参考文献：

1. Chang R, Chu X, Zhang J, et al. Liposome-Based Co-Immunotherapy with TLR Agonist and CD47-SIRPα Checkpoint Blockade for Efficient Treatment of Colon Cancer. Molecules. 2023;28(7):3147.

DOI：10.3390/molecules28073147

论文链接：https://www.mdpi.com/1420-3049/28/7/3147

2. Fu R, Chang R, Peng A, et al. Efficient treatment of colon cancer with codelivery of TRAIL and imatinib by liposomes. Pharmaceutical Development and Technology. 2024;29(1):52–61.

DOI：10.1080/10837450.2024.2301763

论文链接：https://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/10837450.2024.2301763