卡格列肽的固相合成改进工艺

卡格列肽(Cagrilintide)是一款由诺和诺德公司开发的新型长效脂化修饰胰岛淀粉素(amylin)类似物。卡格列肽由37个氨基酸组成，C末端为酰胺型，N末端的α氨基连接1个γGlu和1个二十烷二酸(C20diacid)，其氨基酸序列为C20 diacid-γGlu-KCNTATCATQRLAEFLRHSSNNFGPILPPTNVGSNTP-NH2(cycl2-7)。胰岛淀粉素通过激活位于延髓和下丘脑的特定受体，产生饱腹感，同时在非低血糖状态下抑制餐后胰高血糖素分泌，并延缓胃排空，有助于调控血糖处于稳态。因此，研发并优化胰岛淀粉素类似物用于体质量管理和糖尿病治疗的潜力巨大。根据一项为期68周的I期临床试验报道，卡格列肽与司美格鲁肽的复方制剂CagriSema减重效果可达22.7%，并显示出良好的安全性和耐受性。目前卡格列肽的制备工艺报道较少，仅有1篇专利合成工艺。仅报道了采用常规固相合成方法的生产工艺。

背景技术

目前，长肽的制备方法主要采用基因重组法和化学合成法。由于基因重组法所得多肽的C末端为羧基，需通过在C末端增加一个Gly，再采用肽基甘氨酸a酰胺化单加氧酶(peptidyl-glycinealpha-amidating monooxygenase,PAM)水解Gly，以实现C末端酰胺化。因PAM成本高昂，所以C端酰胺型多肽的合成主要采用固相合成法。以往，对类似多肽的合成通常使用1-羟基苯并三唑/N,N"-二异丙基碳二亚胺作为缩合剂，而本研究拟采用爆炸风险更低、消旋化副反应更少和偶联效率更佳的2-肟氰乙酸乙酯(Oxyma)。本文以RinkAmide AM树脂为固相载体，Oxyma和DIC为缩合试剂，依次将Fmoc保护氨基酸与树脂偶联，得到卡格列肽树脂肽，经三氟乙酸裂解得到还原型卡格列肽粗品，再经过环化、分离、纯化、冻干得到高纯度卡格列肽。

该研究系统探讨和优化了相关制备工艺参数，可为卡格列肽的工业化生产提供借鉴。

中文名称：卡格列肽

英文名称：Cagrilintide

公司编号：GT-F064

CAS号：1415456-99-3

序列：C20 diacid-γGlu-KCNTATCATQRLAEFLRHSSNNFGPILPPTNVGSNTP-NH2(cycl 2-7)

分子式：C194H312N54O59S2

分子量：4409.1

1、树脂溶胀

称取取代度为0.28mmol/g的Rink Amide AM树脂1.0g(0.28mmol)，置多肽合成仪的反应器中，加入DMF 15mL，搅拌60min，使树脂充分溶胀，氮气鼓吹，除去溶液，剩余物用DMF10mL洗涤(2minx2)。

2、脱Fmoc保护基

向溶胀好的树脂加入含20% PIP的DMF溶液10mL，搅拌(15minx2)后过滤;剩余物用DMF 10mL洗涤2次，再用甲醇10mL洗涤2次，最后用DMF10mL洗涤2次。取少许树脂加入茚三酮检测试剂A 40uL和B 40uL,置沸水浴中加热5min,判断Fmoc去除程度，若树脂呈紫黑色则说明脱保护完全。

3、首个氨基酸的缩合

称取Fmoc-Pro-OH 189mg(0.56mmol,2eq)、Oxyma 120mg(0.84mmol,3eq)、DIC 106mg(0.84mol,3eq)，用DMF10mL溶解，预活化30min，投入反应器中，在氮气保护下反应，每隔1h用茚三酮显色法检测，若树脂呈现无色或淡黄色则表示反应完全，反之则需要继续反应。

4、剩余氨基酸的缩合

缩合反应结束后，过滤除去母液，树脂用DMF 10mL洗涤1次，再用甲醇10mL洗涤2次，最后用DMF 10mL洗涤2次。根据卡格列肽的序列，从C端到N端偶联氨基酸,重复“2”项和“3”项下操作，直至全部氨基酸缩合完毕。最后用DCM10mL和甲醇10mL交替洗涤3~6次，减压干燥24h，得到黄色树脂肽3 220mg。固相合成过程如下图所示。

5、树脂肽裂解与工艺优化

在酸裂解过程中，除了目标产物外，还会产生多种副产物，一般需要在裂解试剂中加入清除剂以捕获碳正离子。根据1的氨基酸组成以及合成时采 用的侧链保护基，选取PhOH、水、Tis、PhSMe、EDT、DODT等作为清除剂。其中，PhOH能捕获tBu,  也易于与氧化剂反应；水能清除tBu和Boc;Tis能还原裂解过程中的敏感基团(如二硫键); PhSMe有助于去除Trt和Pbf, 并减少Cys侧链的氧化；EDT也能够清除tBu, 并减少Cys侧链的氧化；DODT是EDT的一种替代品，具有恶臭较小的优点。

裂解方法：按表1配制各组裂解液，各200μL,  分别与树脂肽20mg在20℃反应2h, 用乙醚1.6 mL沉淀，离心(9660×g)5min;沉淀用乙醚洗涤3次，干燥后用水1mL溶解，经孔径0.22μm的水系聚醚砜滤膜过滤，用HPLC法分析。色谱条件如下：色谱柱YMCC4分析柱(4.6mm×250mm,5μm);  流动相A为0.05%TFA水溶液B为0.05%TFA乙腈溶液，梯度洗脱(0—5 min,B25%;5—25 min,B25%—65%);检测波长215nm;流速1mL/min;  柱温45℃;进样量10μL。

结果如表1所示，配方F裂解液的成分较为简单， 且裂解所得还原型的卡格列肽峰面积较大。

裂解时间优化

通常增加反应时间有利于提高收率，但过长的反 应时间也会增加副反应的发生风险，所以需要选择合 适的反应时间。选用配方F裂解液，按“2.2.1”项下裂解方法操作，在反应1.5、2.0、2.5、3.0、3.5h  时分别取样检测，对裂解时间进行优化。结果如下图所示，反应2.0h时，还原型卡格列肽主峰纯度和峰面积时间/h均较高，故确定裂解时间为2.0h。

裂解温度优化

裂解温度的变化对反应的影响尤为明显，温度 较低会降低裂解效率，较高则会影响肽的稳定性，因此对裂解温度进行优化。设置如表2所示的反应温度进行裂解试验，采用配方F裂解液，裂解2.0h,   其他条件同“2.2.1”项，所得结果见表2。可见，在25℃下反应，所得卡格列肽主峰纯度和峰面积均较高。因此，后续试验的裂解温度设置为25℃。

小结

综上所述，最终优化裂解工艺如下：取干燥的树脂肽1.0g,    加入裂解液(由TFA、PhOH、DODT、Tis组成，体积比为90:2 . 5:5:2.5) 10 mL,  于25℃搅拌反应2h。反应液用砂芯漏斗过  滤，滤液加入冷乙醚(-20℃)80mL,  搅拌5min   后在-20℃静置30min, 离心，弃去上层清液，白色沉淀用乙醚洗涤3～6次，减压干燥。最终得白色固体(还原型1粗肽)325mg 。按式①计算得合成收率为38.56%。

合成收率=(实际粗肽质量×含量)/理论粗肽质量×100%① 含量=(粗肽峰面积/进样体积)/(标准品峰面积/进样体积)

本研究采用Fmoc固相合成策略，以Rink Amide AM树脂为载体，采用2倍投料比、Oxyma/DIC为缩合试剂进行固相合成，采用由TFA、PhOH、DODT、Tis( 体积比为90:2.5:5:2.5)组成的  裂解液，于25℃裂解2h后得还原型1;经碘氧化0.5h后，使用乙酸、水、乙腈组成的流动相体系、C₄-30nm制备柱进行一步反相HPLC纯化，最终以26.14%的路线总收率得到卡格列肽,HPLC纯度为98.00%。

本文主要研究了卡格列肽的制备工艺，并旨在提高反应收率、降低工艺难度，为其工业化生产提供参考。 下一步，将对自制的卡格列肽进行细胞水平和动物水平的  活性评价。此外，后续研究将采用二肽氨基酸、固相合成/液相合成混合法等合成策略，进一步探索产品的最佳合成工艺。

卡格列肽的制备工艺开发 (1).pdf

参考文献:段煜,东圆珍,王成成,等. 卡格列肽的制备工艺开发[J]. 中国医药工业杂志,2025,56(8):1017-1026.