H9C2 细胞培养保姆级 SOP 及注意事项

H9C2 为大鼠心肌细胞，是心肌损伤、氧化应激、心血管相关模型研究常用贴壁细胞。细胞呈长梭形 / 纺锤形，严格贴壁、间隙极小、局部会轻微层叠扎堆，该细胞对血清、培养基糖浓度敏感，传代密度把控不当易出现堆叠老化，分化失控，状态极易受环境、操作、血清质量影响，本文将针对H9C2的细胞培养流程进行梳理和指导。

一、细胞复苏

1.【准备工作】水浴锅提前预热至 37℃；准备 9ml 培养基在37℃条件下预热；生物安全柜提前使用紫外照射 30min；

2.【融化】从液氮取出冻存管，37℃水浴快速摇晃融化，约 1-2min；

3. 【重悬】使用75% 酒精擦拭冻存管外壁，生物安全柜内开盖，将细胞悬液缓慢滴入装有 9ml 预热完全培养基的 15mL 离心管中；

4.【离心】600rpm 离心 5min，弃上清；

5.【重悬】加入1ml完全培养基轻轻吹打10次细胞悬液。准备一个新的10cm培养皿，在皿盖上标注细胞名称、传代人、代数、日期。加入9ml完全培养基，再加入1ml细胞悬液。画十字混匀，使细胞在皿中均匀分布；

6.【培养】放入培养箱中培养。

二、细胞传代

1.【实验准备】配制完全培养基：DMEM（abs9483-500mL）+10%FBS（abs972-500ml）+1%P/S（abs9244-100ml）。提前取出 PBS（abs962-500ml）、完全培养基、0.25% EDTA - 胰酶（abs47047375-100mL），恢复至室温；生物安全柜提前使用紫外照射 30min。

2.【镜检】在显微镜下观察细胞，细胞密度约 80%，且细胞形态规整即可进行传代；

3.【细胞清洗】吸弃旧培养基，沿着培养皿壁缓慢加入 2ml PBS，轻轻摇晃培养皿让 PBS 均匀覆盖，吸弃 PBS；
注意：如果镜检下漂浮死细胞较多，可以再用 PBS 清洗一遍。

4.【细胞消化】加入 1ml 胰酶，轻轻晃动培养皿使得胰酶均匀分布，放至 37℃培养箱中进行消化 1-2min；

5.【细胞收集】显微镜下观察到细胞变圆、回缩、间隙变大，立即加入 2ml 含血清的完全培养基终止消化。轻轻吹打皿底的细胞，使细胞脱落，并收集细胞至 15ml 离心管中；

6.【离心】1000rpm 离心 5min 后，用枪头吸弃上清；加入 2ml 完全培养基，轻轻吹打 10-15 次重悬细胞；
注意：该细胞传代比例 1:3-1:4，可根据传代比例加入适量完全培养基。

7.【传代】准备一个新的10cm培养皿，在皿盖上标注细胞名称、传代人、代数、日期。加入9ml完全培养基，再加入1ml细胞悬液。画十字混匀，使细胞在皿中均匀分布；

8.【镜检】在显微镜下观察细胞状态及细胞是否均匀分布，放入37℃，5%CO2培养箱中培养，每隔24H观察细胞状态；
注意：不可使H9C2细胞生长过密至完全汇合、满层易堆叠老化、分化失控（接触抑制弱，切勿长时间高密度静置培养）。细胞密度达到80%即可传代，每周至少传代2~3次。该细胞对胎牛血清比较敏感，建议使用爱必信优级血清，用高糖 DMEM，低糖会抑制增殖。

三、细胞冻存

1.【准备工作】细胞冻存液可使用无血清细胞冻存液（abs9417-100mL），也可以自行配制：90%FBS（abs972-500mL）+10%DMSO（abs9187-100mL）。存管提前标注：细胞名称、代数、冻存人、冻存日期。生物安全柜提前使用紫外照射30min；
注意：该细胞对冻存密度敏感，建议单个皿冻存2-3只。

2.【细胞收集】细胞密度长到80%左右，按照传代步骤进行细胞收集，600rpm离心之后弃上清；

3.【细胞重悬】加入3ml细胞冻存液，轻轻吹打重悬细胞；

4.【冻存】每管加入1ml混合液至冻存管中，将冻存管放入冻存盒中，放入-80℃冰箱，过夜后转移至液氮罐中。

四、关键注意事项

1、严格控制传代密度
不可使H9C2细胞生长过密至完全汇合、满层易堆叠老化、分化失控（接触抑制弱，切勿长时间高密度静置培养）。细胞密度达到80%即可传代，每周至少传代2~3次。

2、血清及培养基选择
（1）该细胞对胎牛血清比较敏感、建议使用优级血清培养；
（2）用高糖 DMEM，低糖会抑制增殖；
（3）该细胞更换血清时，建议使用梯度更换的方式。

3、污染控制
易支原体感染，表现为长势慢、形态变差、莫名漂浮；定期支原体检测，操作全程无菌。

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