标签蛋白亲和层析保姆级仪器&重力Protocol，小白必收藏！

标签蛋白亲和层析是生物研究中核心的蛋白质分离技术，其本质是通过在目标蛋白的 N 端或 C 端融合一段具有特定理化性质的多肽（即 “标签”），利用标签与特定配体之间的特异性相互作用，实现目标蛋白的高效分离与富集。

标签蛋白亲和层析具有特异性强、操作简便、纯化效率高、回收率高且能保持蛋白活性等显著优势，已成为重组蛋白表达后分离纯化的首选技术，经常用于标签蛋白纯化的第一步。

标签蛋白亲和层析基于生物分子间的特异性识别与结合的原理：融合标签的目标蛋白通过层析柱时，标签与层析柱上的配体发生特异性相互作用而被吸附，杂蛋白则因不具有标签直接流出；随后通过改变洗脱条件（如调节 pH 值、离子强度或加入竞争性配体），使目标蛋白与配体解离，从而获得高纯度的重组蛋白。

一、常用标签的分类及特性介绍

1、His 标签（组氨酸标签）

His 标签是最常用的亲和标签之一，通常由 6-10 个连续的组氨酸残基组成（以 6×His 标签最为常见）。其核心作用机制是组氨酸残基中的咪唑环能与镍离子（Ni²⁺）、钴离子（Co²⁺）等过渡金属离子发生特异性螯合作用，从而实现目标蛋白的吸附与纯化。

- 优势：

分子量小（6×His 约 0.8 kDa），对目标蛋白的结构、功能及细胞定位影响极小，通常不需要切除；

可在天然或变性条件下进行，可直接用于包涵体柱上复性和纯化；

免疫原性较低；

- 缺点：特异性相对较弱，部分富含组氨酸的杂蛋白可能会发生非特异性结合，导致纯化产物纯度下降，可通过优化洗脱条件（如梯度咪唑洗脱）改善。

2、GST 标签（谷胱甘肽 S - 转移酶标签）

GST 标签是一种分子量较大的融合标签（约 26 kDa），来源于大肠杆菌的谷胱甘肽 S - 转移酶。其纯化原理是 GST 能与固定在层析介质上的谷胱甘肽（GSH）发生特异性结合，通过谷胱甘肽洗脱可获得目标蛋白。

- 优势：

结合特异性高，纯化产物纯度通常较高；

具有促进蛋白折叠的作用，可提高重组蛋白的可溶性，尤其适用于表达易形成包涵体的蛋白；

纯化条件温和，能最大程度保持蛋白活性；

- 缺点：

分子量较大，可能会影响目标蛋白的结构与功能，尤其对小分子蛋白的影响更为显著；纯化后可通过肠激酶（货号：UA070095），凝血酶（货号：27084601），rTEV酶（货号：UA070003），HRV 3C酶（货号：UA070044）等切除标签。

3、MBP 标签（麦芽糖结合蛋白标签）

MBP 标签来源于大肠杆菌的麦芽糖结合蛋白，分子量约 42 kDa，其纯化原理是 MBP 能与固定化的麦芽糖或直链淀粉发生特异性结合，通过麦芽糖洗脱实现纯化。

- 优势：

具有极强的促可溶性作用，远优于 GST 标签，是表达难溶性蛋白的首选标签之一；

结合特异性高，纯化产物纯度高；

纯化条件温和，能最大程度保持蛋白活性；

- 缺点：

分子量较大，可能会影响目标蛋白的结构与功能，尤其对小分子蛋白的影响更为显著；纯化后可通过肠激酶（货号：UA070095），凝血酶（货号：27084601），rTEV酶（货号：UA070003），HRV 3C酶（货号：UA070044）等切除标签。

4、Strep 标签（链霉亲和素结合标签）

Strep 标签是一类短肽标签，常用的 Strep II 标签由 8 个氨基酸残基组成（WSHPQFEK），分子量约 1 kDa。其纯化原理是 Strep 标签能与链霉亲和素的改造体（Strep-Tactin）发生特异性结合，通过生物素或脱硫生物素洗脱实现纯化。

- 优势：

特异性极高，几乎无非特异性结合，纯化产物纯度高；

分子量小，对目标蛋白影响小；

可在天然或变性条件下进行，可直接用于包涵体柱上复性和纯化；

- 缺点：

价格较高，纯化成本高于 His 标签与 GST 标签；

需使用高浓度生物素洗脱，可能影响部分蛋白的活性。

5、Protein Select 标签（Cytiva专利）

Cytiva Protein Select填料是一种亲和层析填料，用于纯化使用自我裂解且不留痕迹的Cytiva Protein Select标签的重组蛋白，获得无标签的天然蛋白质。

- 优势：

使用Protein Select填料纯化时，蛋白发生自裂解去除标签，在洗脱时没有残留的标签氨基酸；

- 缺点：

无成品质粒载体，需要自己构建质粒时添加Protein Select标签；

6.FLAG 标签

FLAG 标签是由 8 个氨基酸残基组成的短肽标签（DYKDDDDK），分子量约 1 kDa。其纯化原理是通过抗 FLAG 抗体与标签的特异性免疫结合实现目标蛋白的富集，可通过 FLAG 肽段竞争洗脱。

- 优势：

特异性高，抗 FLAG 抗体的识别具有高度专一性，纯化产物纯度高；

分子量小，对目标蛋白影响小；

- 缺点：

填料价格较高，纯化成本高；

抗体与标签的结合可能受缓冲液成分影响；

难再生，不适合重复使用或者批量使用；

二、标签选择策略与影响因素

选择合适的标签是实现目标蛋白高效纯化的关键，需综合考虑目标蛋白的特性、表达系统、实验目的、纯化成本等因素：

（一）根据目标蛋白的特性选择

1、蛋白可溶性：若目标蛋白为易溶性蛋白，优先选择分子量小、对蛋白结构影响小的标签（如 His 标签、Strep 标签）；若目标蛋白为疏水性强、易形成包涵体的难溶性蛋白，应选择具有促可溶性作用的标签（如 MBP 标签、GST 标签），其中 MBP 标签的促溶效果最优，是难溶性蛋白的首选。

2、蛋白分子量：对于小分子蛋白（分子量＜20 kDa），如果使用分子量较大的标签（如 GST、MBP）会占据目标蛋白的大部分空间，影响其结构与功能，需要切除标签；

3、样品及缓冲液成分：如果缓冲液或者样品中含有变性剂等成分，应选择变性环境可用的标签（如 His 标签、Strep 标签），GST，MBP，Flag标签在变性环境下不可用；如果样品中含有高浓度咪唑或者DTT成分，不适合使用普通的His标签纯化柱，可以使用耐受性高的Ni Excel预装柱和填料（货号：29048586, 17371201）;

（二）根据实验目的选择

1、实验室小规模制备（如蛋白结构解析、功能验证）：如需快速获得高纯度蛋白，优先选择 His 标签（操作简便、成本低）；如果蛋白可溶性差，选择 GST，MBP 标签；如果样品量较少（膜蛋白等），优先选择高特异性标签（Strep标签）；

2、工业级大规模生产（如生物制药）：需综合考虑纯化效率、成本、产物安全性等因素。His 标签因成本低、流程简便，是工业生产的常用选择；Strep 标签因特异性高、产物纯度高，适用于对纯度要求极高的药物生产，但需权衡成本；GST，MBP标签需要酶切，增加步骤和成本；

三、标签蛋白纯化步骤

（1）使用蛋白纯化仪器纯化

以下以Cytiva的HisTrap HP 5ml（货号：17524801）的预装柱为例为大家介绍。根据使用的标签，选择对应的纯化产品：使用纯化填料选择小助手：三步选出最合适产品https://mobile.univ-bio.com/pageA/proteinTool2/proteinTool2

前期质粒构建和蛋白表达的流程可以参考：原核标签蛋白纯化解决方案https://www.univ-bio.com/study-center/solution/Technology/PPP.html

正文：

1、配制缓冲液

按照以下配方进行缓冲液配制，

结合缓冲液： 20mM 磷酸钠缓冲液， 0.5M 氯化钠， 20-40mM 咪唑， PH7.4

洗脱缓冲液： 20mM 磷酸钠缓冲液， 0.5M 氯化钠， 500mM 咪唑， PH7.4

缓冲液配制完成后需要预先过滤和超声去除气泡。

其他层析柱所需缓冲液参考说明书进行配制。

2、样品处理

大肠杆菌菌体通过离心收集（16,000g for 3 min），菌体沉淀用裂解液进行悬浮（100 μl of 50 mM Tris–HCl buffer, pH 8.0, containing 200 mM NaCl, 2% Triton X-100 and 3 mM protease inhibitor PMSF），然后冰上超声20次（sonicated 3 s with 7 s intervals between each pulse）。

离心取上清，用0.45um滤膜进行过滤。

3、开机

先打开仪器主机电源，再打开电脑，仪器Power灯持续闪烁之后，打开Unicorn软件并连接仪器；

4、泵洗

实验所需溶液入口浸入去离子水，进行A，B泵泵洗；实验所需入口浸入所需缓冲液，进行A，B泵泵洗；

5、样品打入上样环

连接上样环至样品进口阀，先使用注射器用去离子水冲洗上样环，然后用结合缓冲液润洗上样环，然后打入样品；

6、设置报警压

设置Pre column pressure为0.5 MPa，Delta Column pressure为0.3 MPa。

7、连接层析柱

先系统给一个0.2ml/min的低流速，然后选择柱位，然后使用液滴对液滴的方式连接层析柱；

8、平衡层析柱

先用3-5个柱体积的蒸馏水冲洗乙醇，然后用5个柱体积的结合缓冲液平衡柱子，建议流速为5ml/min。（1ml体积柱子流速为1ml/min）；

9、上样

将Injection valve的状态改为Inject；

10、洗杂

用结合缓冲液洗涤至少 10 到 15 个柱体积，直到吸收峰达到稳定基线或在流出物中没

有物质流出。洗涤过程中建议保持流速为 5ml/min。（1ml体积柱子流速为1-2ml/min）；

11、洗脱

用洗脱缓冲液采用一步洗脱或者线性梯度洗脱（洗脱液浓度梯度0% to 100%）。一步洗脱通常 5 个柱体积，线性洗脱通常 10-20 个柱体积。在洗脱过程中保持流速为5ml/min。（1ml体积柱子流速为1-2ml/min）；

12、再生

洗脱后，用 3-5 个柱体积的结合缓冲液洗涤柱子，然后加入 20%乙醇。拧上柱子上下的堵头，防止柱子变干。

13、跑胶检测

（2）重力纯化

左上角：

以下以Cytiva的Ni Sepharose 6FF 5ml（货号：17531806）的填料为例为大家介绍。根据使用的标签，选择对应的纯化柱产品：使用纯化填料选择小助手：三步选出最合适产品https://mobile.univ-bio.com/pageA/proteinTool2/proteinTool2

前期质粒构建和蛋白表达的流程可以参考：原核标签蛋白纯化解决方案https://www.univ-bio.com/study-center/solution/Technology/PPP.html

正文：

1、配制缓冲液

按照以下配方进行缓冲液配制，

结合缓冲液： 20mM 磷酸钠缓冲液， 0.5M 氯化钠， 20-40mM 咪唑， PH7.4

洗脱缓冲液： 20mM 磷酸钠缓冲液， 0.5M 氯化钠， 500mM 咪唑， PH7.4

缓冲液配制完成后需要预先过滤和超声去除气泡。

其他层析柱所需缓冲液参考说明书进行配制。

2、样品处理

大肠杆菌菌体通过离心收集（16,000g for 3 min），菌体沉淀用裂解液进行悬浮（100 μl of 50 mM Tris–HCl buffer, pH 8.0, containing 200 mM NaCl, 2% Triton X-100 and 3 mM protease inhibitor PMSF），然后冰上超声20次（sonicated 3 s with 7 s intervals between each pulse）。

离心取上清，用0.45um滤膜进行过滤。

3、层析空柱准备

将滤膜放入重力空柱中，用20%乙醇润洗滤膜，再用蒸馏水润洗滤膜；

4、填料准备

轻柔震荡直到填料悬浊液均一，将需要量的悬浊液从瓶中转移至离心管中，Ni Sepharose 6FF填料的载量是40mg His标签重组蛋白/ml填料，例如需要纯化100mg蛋白，则需要3ml填料。（每种填料的载量不同，需参考说明书）。

5、平衡填料

将填料放入重力空柱中，先用5个柱体积去离子水平衡填料，再用5个柱体积的结合缓冲液平衡填料；

6、样品结合

将填料转移至离心管中，加入结合缓冲液和样品，放在摇床上缓慢摇晃1h，让样品和填料充分混合；

7、洗杂

垂直放置重力空柱，将填料和样品混合物加入到重力空柱中；用结合缓冲液冲洗5-10个柱体积，收集流出物；

8、洗脱

用洗脱缓冲液冲洗5-10个柱体积，收集流出物；

9、再生

洗脱后，用 3-5 个柱体积的结合缓冲液洗涤柱子，然后加入 20%乙醇。拧上柱子上下的堵头，防止柱子变干。

10、跑胶检测

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