抗体偶联物纯化：非亲和层析技术全攻略

抗体偶联物是免疫检测、诊断试剂与蛋白研究的核心试剂，常见类型包括酶标抗体、荧光标记抗体、生物素 / 亲和素标记抗体。抗体与小分子偶联后，会出现电荷、疏水性、分子量不均一的问题，单纯依靠亲和层析难以实现高质量分离。

本文围绕离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤层析三类非亲和纯化方式，结合实际图谱案例，讲解不同抗体偶联物的纯化思路，在去除未反应原料的同时，最大程度保护复合物活性与稳定性。

一、抗体偶联物纯化要点

不同偶联目标对标记比例要求不同：

酶标抗体：低偶联比例更利于保留抗体结合力与酶活性

荧光抗体：适当提高偶联比例可增强信号，但过度修饰易导致聚集、荧光淬灭

生物素 / 毒素类偶联物：高比例可提升结合能力，但需避免改变蛋白特性

因此，根据分子量、电荷、疏水性差异选择层析策略，是纯化成功的关键。

二、酶标抗体的纯化方案

1. HRP 标记抗体纯化

HRP（辣根过氧化物酶）分子量约 44 kDa，游离酶易去除，但 1:1 偶联物与游离抗体较难分离，通常采用足量酶进行反应。

图 1 凝胶过滤层析分离 HRP - 抗体偶联物

（采用 Superdex 200 填料，依据分子量差异分离游离抗体、HRP - 抗体复合物及游离酶）

图 2 疏水层析分离 HRP - 抗体偶联物

（利用偶联后疏水性差异，实现复合物与未偶联抗体的高效分离）

2. AP 标记抗体纯化

AP（碱性磷酸酶）分子量约 140 kDa，与抗体偶联后分子量差距明显，纯化难度更低。

图 3 阴离子交换层析分离 AP - 抗体偶联物

（AP 标记抗体在阴离子交换柱上保留更强，可清晰分离游离抗体与偶联产物）

三、荧光标记抗体的纯化方案

荧光素多为疏水性小分子，偶联后会显著改变抗体电荷与疏水性，凝胶过滤效果差，优先使用离子交换与疏水层析。

图 4 离子交换 & 疏水层析分离荧光素标记抗体

（两类方法均可高效区分不同标记程度的抗体偶联物）

图 5 阴离子交换层析分离不同偶联比例 FITC 标记抗体

（上图依次为：低偶联比例、适宜偶联比例、过度偶联比例；黑色框为过度修饰导致的聚集沉淀峰）

四、生物素 / 亲和素标记抗体纯化

生物素标记比例通常较高（＞5），对偶联物电荷与疏水性影响显著。

图 6 离子交换 & 疏水层析分离生物素标记抗体

（阴离子交换、阳离子交换、疏水层析均可用于不同抗体的生物素偶联物分离）

亲和素与链霉亲和素标记抗体特点：

亲和素：等电点高、带正电多、非特异结合强，在阳离子交换柱上保留更强

链霉亲和素：无糖基、无二硫键，疏水性更强，更适合疏水层析分离

小结

抗体偶联物无需依赖单一纯化方式，可根据实际情况组合使用：

分子量差异大 → 凝胶过滤层析

电荷差异明显 → 离子交换层析

疏水性差异大 → 疏水层析

优宁维提供全系列层析填料、预装柱及纯化方案支持，助力您获得高均一性、高活性的抗体偶联物。

常见问题 FAQ

1,抗体偶联物纯化，优先选哪种层析方法？

优先看差异：分子量差大选凝胶过滤，电荷差大选离子交换，疏水性差大选疏水层析。

2,怎么判断偶联比例是否合适？

酶标抗体建议低比例；荧光 / 生物素抗体看峰形，无聚集、无拖尾为适宜比例。

3,过度偶联会有什么后果？

会出现蛋白聚集、活性下降、荧光淬灭、非特异性结合升高等问题。

4,优宁维可以提供哪些相关产品？

凝胶过滤、离子交换、疏水层析填料 / 预装柱、层析系统、缓冲液及整体实验方案。