层析纯化 “蓝胶”：Cibacron Blue 3G-A 配基的应用全解析

在生物大分子纯化领域，Blue 填料（俗称 “蓝胶”）是一款极具辨识度的明星产品，其独特的蓝色外观源于共价偶联的 Cibacron Blue 3G-A（简称 CB）配基。作为少数自带颜色的层析填料，它不仅是血清白蛋白纯化的首选工具，更凭借广泛的结合特异性，成为激酶、脱氢酶、干扰素等多种蛋白及辅酶纯化的核心方案。

作为生命科学领域一站式解决方案服务商，优宁维可为科研与工业用户提供全系列 Blue Sepharose 填料及配套层析技术支持，助力高效完成目标分子的分离纯化。

一、从染料到纯化配基：Cibacron Blue 3G-A 的发展历程

CB 分子最初作为传统纺织染料被应用于衣料染色，其纯化应用的发现源于一次偶然的实验观察。1970 年，研究人员将室温储存 6 个月的蓝色葡聚糖 2000（CB 与葡聚糖的共价结合物）反相加载至 Sephadex G-200 凝胶柱时，发现凝胶柱底部出现蓝色着色，进一步实验证实，这是 CB 分子与凝胶基质非特异性结合的结果。

随后，当研究人员将甜玉米 R - 酶加载至该 “着色” 凝胶柱时，目标蛋白在低盐缓冲液（50 mM Tris-HCl, 0.1 M NaCl, pH 7.5）中完全被保留，仅在提高 NaCl 浓度至 0.5 M 后才被洗脱。这一发现首次证实了 CB 分子可作为亲和配基特异性结合目标蛋白，由此开启了其在生物纯化领域的应用历程。

蓝色葡聚糖 2000 也因兼具 CB 的光谱吸收特性与葡聚糖的生物惰性，成为测定层析填料外水体积的标准工具。

二、Cibacron Blue 3G-A 的核心结合原理

CB 配基的结构中包含蒽醌母核、氨基、磺酸基和苯基，这使其能通过多种模式与目标分子结合，既可以是特异性的核苷酸结合，也可以是离子或疏水作用主导的非特异性结合，甚至是多种模式的协同作用。

1. 特异性核苷酸结合

大多数激酶、脱氢酶及含腺苷酸的辅酶（如 NAD+、NADP+），可通过其核苷酸结合位点与 CB 配基特异性结合，这种结合可通过添加低浓度的游离核苷酸竞争性洗脱。例如：

5 mM NAD 可洗脱酒精脱氢酶

NADP 可洗脱葡萄糖磷酸脱氢酶

提高 pH 值或添加 NAD 可分别洗脱己糖激酶和甘油醛 - 3 - 磷酸脱氢酶

2. 非特异性结合模式

离子作用：在低离子强度下，白蛋白、醛缩酶、细胞色素 C 及多种限制性核酸内切酶（如 BamHI、XbaI）可通过离子相互作用与 CB 结合，通过高盐梯度（如 0~1 M NaCl）或 pH 调整即可实现洗脱。

疏水作用：部分蛋白（如人心脏异柠檬酸脱氢酶）在高盐条件下通过疏水作用结合 CB 配基，此时可通过降低盐浓度或添加乙二醇等极性溶剂进行洗脱。例如，人白细胞干扰素可通过 0.5 M NaCl 洗脱，而成纤维干扰素则需 50% 乙二醇洗脱，体现了不同蛋白与 CB 结合机制的差异。

混合模式结合：部分蛋白（如磷酸葡萄糖异构酶、大鼠肝脏 HMGCR 还原酶）可同时通过离子作用和特异性结合与 CB 互作，因此既可用高盐洗脱，也可通过添加特异性配体（如果糖 6 - 磷酸、NADPH）解离。

3. 金属离子的调控作用

低浓度的 Zn²⁺、Mg²⁺、Al³⁺等金属离子可显著促进部分酶（如羧肽酶 G2、碱性磷酸酶、己糖激酶）与 CB 配基的结合，甚至使原本不结合的蛋白（如卵清蛋白）产生特异性结合。这一效应可能源于金属离子在 CB 与蛋白间形成 “桥接” 络合物，或中和 CB 的负电荷以增强疏水相互作用。

三、优宁维 Blue 填料应用场景

1，血清白蛋白纯化：作为 Blue 填料的经典应用，可从血浆或细胞培养液中高效捕获人血清白蛋白，纯度可达电泳级水平。

2，酶制剂纯化：适用于激酶、脱氢酶、限制性内切酶等多种酶的分离，通过调整洗脱条件可实现高纯度回收。

3，干扰素及凝血因子制备：可特异性结合干扰素、脂蛋白、凝血因子等生物活性分子，为生物制药研发提供关键纯化工具。

常见问题 FAQ

1，Blue 填料只能用于纯化白蛋白吗？

不是的。虽然白蛋白是其经典应用，但 CB 配基的结合特异性广泛，可用于激酶、脱氢酶、干扰素、凝血因子等多种蛋白及辅酶的纯化，优宁维可提供定制化的纯化方案。

2，如何选择 Blue 填料的洗脱条件？

需根据目标蛋白与 CB 的结合模式选择：特异性结合可通过添加游离核苷酸洗脱；离子作用主导的结合可通过高盐梯度洗脱；疏水作用则可通过降低盐浓度或添加极性溶剂洗脱。

3，金属离子在 CB 纯化中起到什么作用？

低浓度金属离子可促进部分蛋白与 CB 的结合，尤其适用于原本不结合 CB 的蛋白（如卵清蛋白），但需注意金属离子浓度过高可能导致蛋白变性。

4，优宁维提供哪些 Blue 填料相关产品？

优宁维提供全系列 Blue Sepharose 6 Fast Flow 等预装柱及散装填料，同时提供层析系统、缓冲液配方优化及技术支持服务，助力用户高效完成纯化实验。