Calcein AM/PI双染色：原理、技术与应用的细胞活性检测

在现代细胞生物学、药理学、毒理学以及再生医学等研究领域，准确、快速地区分并量化活细胞与死细胞是评估细胞健康状态、药物疗效与毒性以及材料生物相容性的基石。自上世纪八十年代钙黄绿素乙酰氧基甲酯（Calcein-AM）与碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）联合使用方案确立以来，Calcein AM/PI双染技术凭借其原理清晰、操作简便、结果直观、兼容性强且对活细胞毒性极低等突出优点，已成为实验室中细胞活力与细胞毒性检测的技术标准之一。

一、核心原理

Calcein AM/PI双染技术的卓越之处在于其同时利用了活细胞的两个关键生物学特性：活跃的代谢酶活性和完整的细胞膜屏障功能。

Calcein-AM是一种疏水性的非荧光分子。由于其脂溶性，它可以自由地被动扩散，穿过完整、健康的活细胞质膜进入细胞质。一旦进入胞内，Calcein-AM即被细胞质中广泛存在的内源性非特异性酯酶水解，切去其乙酰氧基甲酯（AM）基团，转变为高度水溶性的钙黄绿素（Calcein）。生成的Calcein分子带有负电荷，无法再透过完整的脂质双分子层膜而逸出细胞，因此被有效地“囚禁”在活细胞质内。Calcein在蓝光（约490 nm）激发下，会发射出强烈的绿色荧光（约517 nm）。因此，绿色荧光的有无及强弱直接反映了细胞的存活状态及其代谢活性的水平。

与之互补，碘化丙啶（PI）是一种经典的核酸染料。PI分子本身不能穿透完整无损的活细胞膜。然而，当细胞发生凋亡晚期、坏死或其他严重损伤时，细胞膜完整性丧失，通透性异常增加。此时，PI得以进入细胞，并特异性地插入细胞核（或线粒体）的双链DNA/RNA碱基对中。一旦与核酸结合，PI在绿光（约535 nm）激发下会发出明亮的红色荧光（约617 nm）。因此，红色荧光的出现特异性地指示了细胞膜的破损，即细胞的死亡或濒死状态。

Calcein AM/PI双染原理示意图

最巧妙的设计在于，两种染料的最佳激发波长相近（均可被~490 nm光有效激发），而发射波长不同（绿 vs. 红）。这使得研究人员可以在荧光显微镜下，使用单一激发滤片同时观察两种信号：活细胞呈现均匀的绿色胞质荧光，而死细胞则呈现明亮的红色核荧光。若使用545 nm激发，则可选择性观察死细胞。这种设计极大地简化了操作并提高了检测效率。

二、操作流程与注意事项

1、试剂准备

将试剂盒组分Calcein-AM和PI母液，用无血清、无酚红的缓冲液（如PBS或HBSS）稀释成工作液。典型终浓度：Calcein-AM为1-2 µM，PI为2-5 µM。工作液需现配现用，避免Calcein-AM在水中分解。

2、细胞样本处理与染色

针对贴壁细胞（如96孔板）：弃去含血清的培养液，用预热的PBS轻柔洗涤1-2次，以去除残留的血清酯酶（防止背景增高）。每孔加入适量染色工作液，确保覆盖细胞。37°C避光孵育15-30分钟。

针对悬浮细胞：离心收集细胞，PBS洗涤1-2次。用少量PBS重悬，调整密度后与染色工作液混合，37℃避光孵育15-30分钟。

孵育后，对于贴壁细胞，可直接观察或更换新鲜培养基；对于悬浮细胞，可离心洗涤后重悬观察。

3、图像采集与观察

使用配备FITC（绿）和TRITC/Cy3（红）通道的荧光显微镜观察。使用~490 nm激发，可同时采集绿色和红色荧光图像。

HeLa诱导凋亡处理后Calcein AM、PI双染结果图

4、关键注意事项

①彻底洗涤去除血清是降低背景荧光的关键；

②Calcein-AM母液对湿气敏感，应分装、避光、-20°C保存，工作液现配现用；

③不同细胞系的酯酶活性不同，初次实验建议优化染料浓度和孵育时间。

④除显微镜外，该技术也兼容流式细胞仪（用于精确定量）和荧光酶标仪（用于高通量筛查）。

⑤Calcein染色为胞质内可扩散染料，不能使用醛类等固定剂处理，否则染料会丢失。若需后续免疫染色，应先固定并进行靶标染色，最后再进行Calcein AM/PI快速染色并立即观察。

三、结果分析

在荧光显微镜下，结果判定直观：

活细胞：胞质呈现均匀、明亮的绿色荧光，细胞形态正常（贴壁细胞铺展，悬浮细胞饱满）。

死细胞：细胞核呈现明亮的红色荧光，通常无或仅有微弱绿色荧光。

晚期凋亡/严重受损细胞：可能同时呈现较弱的绿色和较强的红色荧光（在合并图像中呈黄/橙色），表明其代谢活性已下降但膜完整性尚未完全丧失。

四、应用场景

1、药物筛选与细胞毒性评价

案例一：光动力疗法药物评估

在一项开发新型光敏剂TPA-S-TPP用于癌症治疗的研究中，用Calcein AM/PI双染评估了其光依赖性毒性。如图所示，HeLa细胞在仅用TPA-S-TPP处理但避光条件下，显示强烈的绿色荧光（C2），极少红色荧光，表明药物本身在黑暗条件下无毒。然而，光照10-30分钟后，绿色荧光显著减弱（D2, E2），红色荧光急剧增强（D3, E3），直观证明该化合物在光照下能有效诱导细胞死亡（凋亡/坏死），为其作为光动力治疗药物的机制提供了关键证据。

DOI：10.1039/d1qm00328c

案例二：纳米载药体系毒性评估

Fan等人开发了一种用于化疗-抗血管生成联合治疗的金属-有机纳米诊疗剂。在评估其细胞毒性时，使用Calcein AM/PI双染试剂盒处理了HeLa、HTdMEC和HUVEC细胞。荧光图像显示，与对照组相比，纳米制剂处理后的细胞中红色荧光（死细胞）比例显著增加，而绿色荧光（活细胞）减少，直接证明了该纳米体系对多种肿瘤细胞和内皮细胞的杀伤效果，为其体内抗肿瘤疗效评估奠定了基础。

DOI:10.1021/acsami.1c22350

2、生物材料与组织工程生物相容性评价

在医疗器械、植入物和组织工程支架的研发中，评估材料对细胞的毒性至关重要。

案例三：糖尿病伤口敷料水凝胶的生物相容性验证

Wang等人在开发一种多功能多巴胺-透明质酸-重组人胶原（HA-DA@rhCol）水凝胶用于糖尿病伤口愈合的研究中，对水凝胶的提取液进行了细胞相容性测试。将成纤维细胞（NIH-3T3）与不同组分的提取液共培养后，进行Calcein AM/PI双染。结果表明细胞在HA-DA@rhCol水凝胶提取液中培养后，与在普通培养板（对照组）中一样，表现出高密度的绿色活细胞，而红色死细胞极少。这一直观的图像证据强有力地证明了该水凝胶材料具有优异的生物相容性，为其作为安全伤口敷料的应用扫清了关键障碍。

DOI：10.1016/j.bioactmat.2024.02.010

3、细胞死亡机制与动态过程研究

结合活细胞成像系统，Calcein AM/PI双染可以实现对细胞死亡过程的实时、动态监测。可以观察药物处理后，细胞是迅速坏死（红色荧光突然出现），还是经历一个缓慢的凋亡过程（绿色先减弱，随后红色出现）。这为研究细胞死亡动力学和机制提供了宝贵工具。

DOI：10.1177/2472555217731076

五、Calcein AM/PI双染优势

Calcein AM/PI双染技术之所以经久不衰，源于其多方面的综合优势：

1、双重指标，结果可靠：同时检测代谢活性和膜完整性，比单一指标方法（如台盼蓝排阻法）更灵敏、准确。

2、操作简便，快速高效：染色过程通常只需30-60分钟，无需复杂步骤。

3、兼容性强，应用广泛：适用于绝大多数真核细胞，兼容显微镜、流式细胞仪、酶标仪等多种检测平台。

4、对活细胞友好：工作浓度下Calcein-AM毒性极低，不影响细胞正常生理功能。

5、成本相对低廉：相较于一些复杂的生化检测，其试剂成本较低。