武汉佰乐博生物技术有限公司

免疫组化（Immunohistochemistry, IHC）是一种利用抗原与抗体特异性结合反应来检测和定位组织和细胞中的某些化学物质的技术。实验过程中涉及众多变量，实验者常常会遇到各种各样的问题，影响到实验结果的准确性和可靠性。今天康妮将对IHC实验中常见的问题进行总结，并提供相应的解决策略，以帮助大家优化实验流程，提高实验成功率！

结果阴性？

● 抗原丢失：组织处理不当，如过度固定、脱水或热处理，可以破坏抗原表位，导致抗体无法识别。确保使用适合特定抗原的固定和处理方法。

● 抗体问题：使用了无效、低亲和力或非特异性抗体。选择经过充分验证、具有高特异性和亲和力的抗体至关重要。

● 抗原修复不足：某些抗原需要特定的抗原修复步骤才能暴露其表位。缺乏或不适当的抗原修复可能导致抗体无法结合。换修复液或加强修复，优化抗原修复条件。

● 检测系统故障：包括酶标记物、底物或显色剂的失效。确保所有试剂在使用前都是有效的，并按照制造商的指南操作。

● 样本问题：样本可能不含目标抗原，或者抗原表达水平极低，不足以被检测到。使用已知表达目标抗原的阳性对照进行比较。

● 实验操作错误：包括样本污染、不充分的洗涤步骤、抗体浓度过低、血清封闭时间过长、DAB孵育时间过短、细胞通透不全抗体未能充分进入胞内参与反应等。

● 信号检测阈值设置过高：在定量或半定量分析中，信号检测阈值设置过高可能使真实的低水平表达被误判为阴性。根据样本和实验目的合理调整检测阈值。

非特异性染色（着色一片黄/背景过深）？

● 抗体交叉反应：抗体可能与样本中的多个抗原或非特异性结构结合，导致非特异性染色。选择高特异性的抗体，进行预吸收或使用竞争抑制实验可以减少这一问题。

● 抗体浓度过高：过量的抗体增加了非特异性结合的机会。优化抗体浓度至最佳范围，通常需要通过预实验来确定。

● 样本处理不当：过度固定、脱水或样本处理过程中使用的溶剂可能暴露出额外的结合位点，促进非特异性结合。优化样本处理步骤，使用温和的固定剂，并避免过度处理。

● 洗涤不充分：不充分的洗涤步骤无法有效去除未结合的抗体或标记物，导致非特异性染色。增加洗涤次数或延长洗涤时间可以改善这一问题。

● 检测系统敏感度过高：过于敏感的检测系统可能会放大非特异性信号。调整检测系统或信号放大步骤的敏感度，以减少非特异性染色。

● 内源性酶活性：在使用酶标记抗体的检测系统中，内源性酶（如过氧化物酶）的活性可能引起非特异性染色。使用内源性酶抑制剂或进行酶失活步骤可以减少这一影响。

● 样本背景复杂：高背景样本可能含有多种潜在的结合位点，增加非特异性染色的可能性。使用封闭步骤（如血清或蛋白封闭液）可以减少背景染色。

假阳性？

● 一抗浓度及一抗是否失效，抗体有一个合适的浓度范围且必须在有效期内使用，过期的抗体或者不着色，或者背景着色，形成假阳性；

● 试剂未充分覆盖组织，组织边缘的试剂易干浓度较组织中间高致深染；

● 抗体孵育时间过长，由于室温的影响夏季孵育时间稍短，冬季孵育时间稍长；

● 操作过程中组织变干，造成组织边缘收缩或损坏形成伪影，产生假阳性；

● DAB显色时间太长，DAB宜现配现用，配制时间最好在30min以内；

● 由于胞浆里含有较多的蛋白质，因此间质和胞浆中出现很多非特异性的染色，如内源性酶血红蛋白、肌红蛋白等造成的着色，可以通过血清封闭解决；

● 乳腺癌组织中的脂肪细胞、淋巴细胞也会产生非特异性的染色；

● 非特异性抗体吸附常见于坏死组织中，使坏死组织呈较高的背景染色，在免疫组化中应避免选择坏死组织较多的蜡块；

● PBS 冲洗不充分，残留抗体结果增强着色；

弱阳性？

● 固定方式不当或固定时温度过高，影响到抗原的数量和质量；

● 不适当的抗原修复方式，抗原决定簇暴露不足；

● 抗体的稀释度是否过高或者孵育的温度/时间不足；

● 孵育抗体前切片上遗留了过多的冲洗液；

● 孵育时切片未放置水平，导致抗体孵育不均匀。

染色不均匀？

● 样本制备不一致：切片厚度不均或样本固定条件的差异，导致染色剂在样本上的分布不均匀。

● 抗体分布不均：抗体溶液在样本上的覆盖不均匀，或在孵育过程中未能充分渗透到样本的所有区域。

● 抗原修复不充分：抗原修复条件（如温度、时间）不一致，导致某些区域的抗原表位未充分暴露。

● 洗涤步骤不彻底：残留的未结合抗体或标记物可能在某些区域积聚，导致染色过深。

● 显色剂应用不均：显色剂在样本上的分布不均，或显色反应时间的不一致。

● 样本内部结构差异：样本内部结构的差异（如细胞密度、组织类型）可能导致染色剂在不同区域的反应性不同。

AntibodySystem

AntibodySystem Laboratories SAS于2019年创立于法国斯特拉斯堡,专注于生命科学研究领域蛋白及抗体试剂研发生产。致力于为全球生命科学基础研究者提供高质量的蛋白，抗体产品，产品类别囊括传统多抗，经典内参抗体，标签抗体，高活性蛋白，invivo功能性抗体，低背景流式抗体，高特异性纳米抗体，特色小分子抗体，高质量磷酸化抗体，DNA/RNA抗体,PEG抗体等十余个系列;目前AntibodySystem旗下产品线涵盖500余种病毒与超级细菌，寄生虫，肿瘤，老年痴呆，帕金森，变态与过敏反应，免疫抑制与免疫激活等多个领域。

佰乐博生物

武汉佰乐博生物（Biolab Reagents）由五位毕业于华中科技大学，华中农业大学，武汉大学等知名高校，且具有二十年工作经验的生命科学领域研究者创立于2021年，凭借丰富的产品开发经验，利用全球技术平台，引进和整合全球高品质的蛋白、抗体和试剂盒产品。目前，佰乐博生物作为法国AntibodySystem和ProteoGenix在亚洲总代理，提供近30,000种生命科学试剂，核心产品涵盖蛋白、抗体和试剂盒，旨在为科研工作者提供专业、全面、可靠的试剂支持，推动生命科学研究的深入发展。