abinScience助力中国农业大学揭秘circCLASP1如何操控免疫细胞帮癌细胞逃逸

乳腺癌是全球女性中发病率最高的恶性肿瘤，约占新增癌症病例的 11.6%，死亡率达 6.9%，严重威胁女性健康。尽管早期诊断和治疗技术不断进步，但仍有部分患者会出现疾病进展和远处转移，其潜在分子机制尚未完全阐明。环状RNA（circRNAs）作为一类具有闭合环状结构的非编码 RNA，在肿瘤发生发展中发挥着miRNA海绵、结合 RNA 结合蛋白、编码多肽等多种生物学功能，已成为肿瘤研究的热点方向。肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）作为肿瘤微环境的重要组成部分，与乳腺癌细胞的 “癌 - 免疫细胞” 串扰在肿瘤进展中起到关键作用。近日，中国农业大学的研究团队发表于《Oncogene》的一项研究“Circular RNA CLASP1 modulates the GLI1/SNAIL axis and enhances macrophage polarization in breast cancer”，深入探讨了 circCLASP1 在乳腺癌中的作用及分子机制，为乳腺癌的诊断和治疗提供了新的靶点和思路。

_{Figure 1. Graph abstract}

circCLASP1 在乳腺癌组织和血清中高表达，具备诊断潜力

研究团队通过重分析 GEO 数据集（GSE71651），筛选出在乳腺癌中差异表达显著的 circRNAs，发现 circCLASP1 是其中表达上调最为明显的分子之一。为验证这一结果，研究者检测了65例乳腺癌组织、42  例癌旁组织、61 例乳腺癌患者血清及 10 例正常血清样本中 circCLASP1 的表达水平，证实 circCLASP1  在乳腺癌组织和血清中均显著高表达。此外，circCLASP1 的表达与淋巴结转移、ki67 表达及肿瘤大小呈正相关，且其半衰期长于线性  CLASP1 mRNA，能抵抗 RNase R 消化，主要定位于细胞质中。这些结果表明，circCLASP1 具有作为乳腺癌诊断生物标志物的潜力。

_{Figure 2. 癌症中circCLASP1的鉴定与表征}

circCLASP1 促进乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭

为明确 circCLASP1 的生物学功能，研究人员设计靶向其反向剪接位点的 shRNA，在乳腺癌细胞系中成功敲低 circCLASP1 表达。功能实验显示，敲低  circCLASP1 后，MDA-MB-231 和 MCF-7 细胞的增殖能力、集落形成能力显著下降，ki67  阳性细胞比例减少，患者来源类器官（PDO）的生长速度和直径也明显降低。同时，Transwell 实验证实，敲低 circCLASP1  能显著抑制乳腺癌细胞的迁移和侵袭能力。细胞周期和凋亡分析显示，敲低 circCLASP1 可导致细胞周期停滞，凋亡细胞数量增加，且 BAX  蛋白水平升高、BCL2 蛋白水平降低。体内实验进一步验证，敲低 circCLASP1 的乳腺癌细胞在裸鼠体内形成的移植瘤重量显著减轻。上述结果表明，circCLASP1 在乳腺癌中发挥癌基因作用，促进肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭。

_{Figure 3. CircCLASP1在BC细胞中作为致癌基因发挥作用}

U2AF2 调控 circCLASP1 的生物合成，参与乳腺癌恶性表型调控

RNA 结合蛋白（RBPs）可通过结合 circRNA 的侧翼序列调控其生物发生。研究通过整合 3 个 RBP 预测数据库，筛选出可能参与 circCLASP1 生物发生的关键上游调控因子 PTBP1 和 U2AF2。功能获得实验显示，过表达  U2AF2 能显著增加 circCLASP1 的表达，而过表达 PTBP1 对 circCLASP1 表达无明显影响。WB结果证实 U2AF2  在乳腺癌组织中高表达，且在淋巴结阳性和 ki67 阳性的乳腺癌患者中，U2AF2 高表达与总生存期缩短相关。相关性分析显示，U2AF2 与  circCLASP1 的表达呈正相关。RIP实验进一步证实，U2AF2 通过结合 circCLASP1 侧翼序列的 “+112~+136”  区域调控其生物发生。拯救实验表明，过表达U2AF2 可增强乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力，而敲低 circCLASP1 能部分逆转这一效应。

_{Figure 4. U2AF2介导circCLASP1的生物合成}

circCLASP1 不通过海绵化 miRNA 或编码多肽发挥作用

考虑到circRNA常通过miRNA 海绵机制调控功能，且circCLASP1 主要定位于细胞质，研究者推测其可能作为 miRNA 海绵调控乳腺癌进展。RIP 实验显示 circCLASP1 能与 AGO2 结合，通过生物信息学预测和筛选，确定 miR-15a-5p 为其潜在靶标。RNA  pull-down 和双荧光素酶报告实验证实，circCLASP1 可与 miR-15a-5p  直接结合。然而，拯救实验表明，miR-15a-5p 过表达无法显著抑制 circCLASP1  过表达介导的乳腺癌细胞增殖、集落形成及迁移侵袭。这些结果表明，circCLASP1 并非通过海绵化 miRNA 或编码多肽发挥癌基因功能。

_{Figure 5. CircCLASP1促进乳腺癌进展而不作为微小RNA的海绵}

circCLASP1 结合 CCT2，抑制 GLI1 的泛素化降解

为进一步探究 circCLASP1 的作用机制，研究人员通过 RNA pull-down 结合质谱分析，筛选出与 circCLASP1 相互作用的蛋白质，发现分子伴侣 CCT2 是其特异性结合蛋白。RIP 实验验证了 circCLASP1 与 CCT2 的相互作用，且 AlphaFold3 模拟显示二者存在稳定的结合结构。免疫共沉淀实验表明，敲低 circCLASP1 会减弱 CCT2 与 GLI1 的相互作用，且 circCLASP1、CCT2 和 GLI1 形成复合物。进一步研究发现，敲低  circCLASP1 不影响 GLI1 的 mRNA 水平，但会降低其蛋白稳定性。CHNO₄（CHX）追踪实验显示，敲低 circCLASP1  会缩短 GLI1 的蛋白半衰期，而蛋白酶体抑制剂 MG132 可逆转这一效应。泛素化实验证实，敲低 circCLASP1 会增加 GLI1  的泛素化水平。在蛋白检测过程中，研究使用了AtaGenix提供的 CDK4 抗体，为实验结果的可靠性提供了有力支持。这些结果表明，circCLASP1 通过结合 CCT2，抑制 GLI1 的泛素化介导降解，从而稳定 GLI1 蛋白。

_{Figure 6. CirCCLASP1结合到CCT2并调节GLI1的泛素介导降解}

circCLASP1 通过GLI1/SNAIL轴调控乳腺癌进展

GLI1 作为转录因子，其核积累是发挥功能的关键。免疫印迹和核质分离实验显示，敲低  circCLASP1 会抑制 GLI1 的核积累。生存分析表明，GLI1 下游靶基因 SNAIL 高表达的乳腺癌患者总生存期显著缩短，且  GLI1 与 SNAIL 在乳腺癌中呈正相关。实验证实，敲低 circCLASP1 会显著降低 SNAIL 的 mRNA 和蛋白水平，且  circCLASP1 与 SNAIL 在乳腺癌组织中表达呈正相关。过表达野生型或 miR-15a-5p 结合位点突变型  circCLASP1，均能增强乳腺癌细胞的增殖、集落形成及迁移侵袭能力，且不影响 CCT2 与 GLI1 的相互作用和 SNAIL  的表达。这些结果表明，circCLASP1 通过 CCT2/GLI1/SNAIL 轴促进乳腺癌进展，且该过程不依赖于 miR-15a-5p。

_{Figure 7.CircCLASP1通过GLI1在转录水平上调控SNAIL的表达}

circCLASP1 通过 SNAIL 调控巨噬细胞招募和极化，促进肺转移

为探究 circCLASP1 对肿瘤微环境的影响，研究者通过免疫组化检测发现，circCLASP1  低表达的乳腺癌组织中 CD68 阳性巨噬细胞数量显著减少，而 CD3 阳性 T  细胞数量无明显差异。条件培养基共培养实验显示，circCLASP1 过表达的乳腺癌细胞条件培养基可促进 THP-1 细胞向 M2  型巨噬细胞极化，而敲低 circCLASP1 则抑制这一过程。RT-qPCR 结果证实，circCLASP1 可调控乳腺癌细胞中 CCL2 和  CCL5 的表达，实时共培养实验显示，circCLASP1 过表达的乳腺癌细胞能显著招募巨噬细胞，Transwell  实验进一步验证了这一结果。体内实验中，通过尾静脉注射 4T1 细胞构建肺转移模型，证实 circCLASP1 过表达可促进乳腺癌肺转移，增加  Snail 表达和巨噬细胞招募，而敲低 Snail 能逆转这些效应。这些结果表明，circCLASP1 通过 SNAIL 调控 CCL2 和 CCL5 表达，进而促进巨噬细胞招募和 M2 极化，加速乳腺癌转移。

_{Figure 8. CircCLASP1增强巨噬细胞在BC细胞中的募集}

本研究系统探讨了 circCLASP1 在乳腺癌中的作用及分子机制，发现 circCLASP1 在乳腺癌组织和血清中高表达，其表达水平与临床病理特征相关，具备作为诊断生物标志物的潜力。功能上，circCLASP1  通过 U2AF2 介导的生物发生途径产生，作为分子支架结合 CCT2，抑制 GLI1 的泛素化降解，促进 GLI1 核积累，进而上调  SNAIL 表达，通过 CCL2/CCL5 轴招募并极化巨噬细胞，最终促进乳腺癌细胞增殖、迁移、侵袭及肺转移。该研究揭示了 circCLASP1  在乳腺癌进展中的关键作用及调控网络，为乳腺癌的诊断和治疗提供了新的靶点。

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abinScience为本研究提供了anti-CDK4抗体（HY215014），蛋白水平的精准检测为机制验证提供了关键支撑，助力科研团队清晰揭示 circCLASP1通过CCT2/GLI1/SNAIL轴调控乳腺癌进展的分子链条。