酶联免疫吸附试验（ELISA）检测过程中的常见干扰因素分析

ELISA（酶联免疫吸附试验）因其高灵敏度和特异性被广泛用于抗原抗体检测，但其结果易受多种内外因素干扰，导致假阳性或假阴性。这些误差可能源于样本本身含有的物质、实验操作不当、试剂质量问题或外部环境变化。识别并控制这些干扰是保证检测可靠性的核心。

干扰因素分类与具体表现

标本相关因素

这是最普遍的干扰来源，分为内源性和外源性两类。

内源性干扰物质：指患者体内天然存在的物质。

类风湿因子 (RF)：可与固相抗体和酶标二抗的Fc段非特异结合，形成“桥连”效应，导致假阳性。

补体：能激活并与抗体结合，暴露C1q结合位点，将固相抗体和酶标抗体交联，造成假阳性；也可能封闭抗原表位，导致假阴性。

异嗜性抗体：人血清中天然存在的抗动物（如鼠）IgG的抗体，可非特异地连接一抗和二抗，引起假阳性。

高浓度非特异免疫球蛋白：可能导致“后带现象”或HD-HOOK效应，在抗原浓度过高时反而出现假低值或假阴性。

外源性干扰因素：由样本采集、处理或储存不当引起。

溶血：红细胞破裂释放的血红蛋白具有过氧化物酶样活性，会催化底物显色，造成假阳性。

脂血（高血脂）：样本脂肪含量过高会干扰抗原抗体反应，可能导致假阴性，建议离心后取中间澄清层检测。

细菌污染：菌体内的内源性酶（如辣根过氧化物酶）可导致非特异性显色。

标本保存不当：保存时间过长、反复冻融会导致蛋白降解或变性，抗原/抗体活性减弱，造成假阴性；4℃长期存放还可能导致IgG聚合成多聚体，引起假阳性。

试剂与设备因素

试剂质量差异：不同厂家或批次的试剂在灵敏度、特异性上存在差异，混用不同试剂盒的组分（尤其是酶结合物）会导致显色异常。

试剂失效：保存条件错误（如该放-20℃的放在4℃）、过期或反复冻融会使试剂活性下降8。

设备性能：移液器未校准会导致加样量不准；洗板机洗涤不彻底或过度、酶标仪未校正均会影响结果准确性。

操作过程因素

加样问题：加样时间过长、量不足或稀释错误，都会影响反应平衡。

洗涤不当：洗涤不充分会残留游离酶标物，导致背景高和假阳性；洗涤过度则可能将已结合的复合物洗脱，造成假阴性。

温育条件：温度和时间不符合要求（如未提前平衡试剂至室温），会影响抗原抗体结合效率。

交叉污染：手洗板时枪头触碰孔壁，可能引入污染物，导致整板失败。

其他因素

抗凝剂干扰：肝素会增加OD值，EDTA和NaN₃等酶抑制剂会抑制辣根过氧化物酶活性。

HD-HOOK效应：在双抗体夹心法中，当待测抗原浓度过高时，会优先与一种抗体饱和，阻碍“夹心”复合物形成，反而导致信号降低，呈现“假低值”。

以下表格总结了主要干扰因素及其影响和应对措施：

建议

为确保ELISA检测结果的准确性，应：

优先检查标本：确保无溶血、脂血、污染，并正确保存。

规范操作流程：严格遵循试剂盒说明书，特别是加样、温育和洗涤步骤。

做好质控：使用前校准仪器，设立阳性和阴性对照，对可疑结果进行复查。

合理选择试剂：选用质量可靠、批号稳定的试剂盒。