人组织蛋白酶K(CATH-K)ELISA KIT

双抗体夹心法 本试剂盒用于测定人血清、血浆、组织匀浆及相关液体样本中组织蛋白酶K(cath-K)的含量。 人 本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人组织蛋白酶K(cath-K)水平。用纯化的组织蛋白酶K(cath-K)捕获抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被的微孔中依次加入组织蛋白酶K(cath-K)，再与HRP标记的检测抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的组织蛋白酶K(cath-K)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中组织蛋白酶K(cath-K)含量。   1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。 2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。 3. 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。 4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。 5. 组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。 6. 标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融。 7. 不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。   1. 标准品的加样：设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL。 2. 加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。 3. 加酶：每孔加入酶标试剂100μl，空白孔除外。 4. 温育：用封板膜封板后置37℃温育60分钟。 5. 配液：将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用。 6. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。 7. 显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟。 8. 终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。 9. 测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。 测定应在加终止液后15分钟以内进行。     可检测样本中人的Cath-K，且与其类似物无明显交叉反应。 组织蛋白酶K（CathepsinK），缩写为CTSK，是一种在人类中由CTSK基因编码的酶。该基因所编码的蛋白是一种溶酶体半胱氨酸蛋白酶，参与骨重塑和吸收。该蛋白是肽酶C1蛋白家族的成员，主要在破骨细胞中表达。CathepsinK是一种蛋白酶，它的定义是对激肽的高度特异性，参与骨吸收。该酶分解弹性蛋白、胶原蛋白和明胶的能力使其能够分解骨和软骨。这种分解代谢活动也是肺气肿中肺部弹性和反冲力丧失的部分原因。白蛋白酶K抑制剂在治疗骨质疏松症方面显示出巨大潜力。白蛋白酶K被白蛋白酶S降解，这一过程被称为受控白蛋白酶食人。