小鼠基质金属蛋白酶13(MMP-13)ELISA试剂盒

双抗体夹心法

小鼠基质金属蛋白酶13(MMP-13)ELISA试剂盒的检测原理：本试剂盒采用双抗体两步夹心酶联免疫吸附法（ELISA）。将标准品、待测样本加入到预先包被小鼠基质金属蛋白酶13多克隆抗体透明酶标包被板中，温育足够时间后，洗涤除去未结合的成分，再加入酶标工作液，温育足够时间后，洗涤除去未结合的成分。依次加入底物A、B，底物（TMB）在辣根过氧化物酶（HRP）催化下转化为蓝色产物，在酸的作用下变成黄色，颜色的深浅与样品中小鼠基质金属蛋白酶13浓度呈正相关，450nm波长下测定OD值，根据标准品和样品的OD值，计算样本中小鼠基质金属蛋白酶13含量。

小鼠 小鼠基质金属蛋白酶13(MMP-13)ELISA试剂盒用于定量或定性检测血清、血浆、组织液的液体样本中的基质金属蛋白酶13(MMP-13)。 本试剂盒应采用双抗体夹心法测定标本中小鼠基质金属蛋白酶13(MMP-13)水平。用纯化的基质金属蛋白酶13(MMP-13)捕获抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被的微孔中依次加入基质金属蛋白酶13(MMP-13)，再与HRP标记的检测抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的基质金属蛋白酶13(MMP-13)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中基质金属蛋白酶13(MMP-13)含量。   1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。 2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。 3. 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。 4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。 5. 组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。 6. 标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融。 7. 不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。   1. 标准品的加样：设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL。 2. 加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。 3. 加酶：每孔加入酶标试剂100μl，空白孔除外。 4. 温育：用封板膜封板后置37℃温育60分钟。 5. 配液：将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用。 6. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。 7. 显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟。 8. 终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。 9. 测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。 测定应在加终止液后15分钟以内进行。     可检测样本中小鼠的MMP-13，且与其类似物无明显交叉反应。 基质金属蛋白酶13（MMP-13），又叫胶原酶3（GLG3），是由MMP13基因编码的酶。它是基质金属蛋白酶家族的成员。像大多数MMP一样，它是作为非活性前体形式分泌的。一旦前结构域被切割，它就会被激活，留下由催化结构域和血红素结合蛋白样结构域PDB组成的活性酶：1PEX。虽然实际机制尚未描述，但血红素结构域参与胶原降解，催化结构域本身在胶原降解方面效率特别低下。在胚胎发育过程中，它在骨骼中表达，这是重组胶原基质以进行骨矿化所必需的。在病理情况下，它被高度过度表达。它的转录调控由于其有效的蛋白水解能力而受到严格控制。已经证明几种细胞因子和生长因子会影响Mmp13基因表达，包括甲状旁腺激素，IGF-1，TGF-β，肝细胞生长因子等。