链霉蛋白酶E

链霉蛋白酶E来源于灰色链霉菌的一组蛋白酶(Protease from Streptomyces griseus),至少包含细胞外丝氨酸蛋白醇在内的三种蛋白酶活性。通常情况，丝氨酸蛋白酶具广谱的底物特异性，通过分子上一一个天冬氨酸，一个组氨酸，和一个丝氨酸组成的活性位点来调控。 链霉蛋白酶E可用于蛋白的大量或者完全降解，还可用来研究蛋白酶抑制剂，以及热失活动力学。本制品常用于核酸分离步骤，在添加0.2%SDS和10 mM EDTA的体系内孵育0.5-3h即可达到目的。 本试剂盒应采用双抗体夹心法测定标本中人钙蛋白酶（Calpain）水平。用纯化的钙蛋白酶（Calpain）捕获抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被的微孔中依次加入钙蛋白酶（Calpain），再与HRP标记的检测抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的钙蛋白酶（Calpain）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中钙蛋白酶（Calpain）含量。   1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。 2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。 3. 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。 4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。 5. 组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。 6. 标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融。 7. 不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。   1. 标准品的加样：设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL。 2. 加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。 3. 加酶：每孔加入酶标试剂100μl，空白孔除外。 4. 温育：用封板膜封板后置37℃温育60分钟。 5. 配液：将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用。 6. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。 7. 显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟。 8. 终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。 9. 测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。测定应在加终止液后15分钟以内进行。