Y187感受态细胞

Y187感受态细胞是实验室常用酵母双杂用菌株，MATα型，可转化质粒或mating操作，Transformationmarker为:trp1,leu2，报告基因为：lacZ,MEL1，经PGADT7质粒检测转化效率为104cfu/μgDNA。Y187-GAL4酵母双杂系统需要两种质粒配套使用：pGBKT7和pGADT7。质粒pGBKT7的筛选标志为TRP1，用于表达DNA-BD(来自酵母转录因子GAL4N端1~174位氨基酸)与目标蛋白(Bait)的融合蛋白；质粒pGADT7的筛选标志为LEU，用于表达AD(GAL4 C端768~881位氨基酸)与目标蛋白(Prey)的融合蛋白。 一个完整的酵母转录因子GAL4可分为功能上相互独立的两个结构域：位于N端1~174位氨基酸区段的DNA结合域(DNA-BD)和位于C端768~881位氨基酸区段的转录激活域(AD)。 1.取100μl冰上融化的Y187感受态细胞，依次加入预冷的目的质粒2-5μg，Carrier DNA(95-100度5 min，快速冰浴，重复一次）10μl，PEG/LiAc 500μl并吸打几次混匀，30度水浴30 min(15 min时翻转6-8次混匀)。 2.将管放42℃水浴15 min(7.5 min时翻转6-8次混匀)。 3.5000 rpm离心40 s弃上清，ddH2O 400μl重悬，离心30s弃上清。 4.ddH2O 50μl重悬，涂板，29℃培养48-96 h。