RNA克隆的应用

背景^[1-7]

RNA克隆是将载体用限制性内切酶双酶切得到线性化的载体；需要同时合成两种序列不完全相同的寡核苷酸片段，这两种寡核苷酸片段在退火后形成双链DNA片段；载体和双链DNA片段通过T4 DNA连接酶连接，得到环型的DNA分子。最后将连接得到的DNA分子转化细菌，通过筛选得到正确的基因克隆。

体外转录合成ShRNAs法，是按照生命合成RNA过程的原理，用转录方法来合成ShRNAs，其ShRNA最接近生命自然状态中的dsRNA，RNA干扰效果也。较化学合成而言，体外转录制备ShRNA的优势在于成本低、质量高、毒性小和稳定性均较好。

转录ShRNAs只要较低的浓度就可以达到化学合成ShRNAs较高浓度得到的效果；而且，直接使用dsRNA易转染，非常有效，使用范围也较广。但是，由于在哺乳动物中不存在RNAi的扩增机制，导入RNA产生的RNAi作用不可避免的具有瞬时性。为了克服这个弱点，现已发展了基于DNA载体在体内表达siRNA的技术，即编码ShRNA的转录DNAs法。

小干扰核糖核酸(siRNA)具有基因沉默作用，发夹状核糖核酸(ShRNA)是siRNA的一种。有研究显示，无论是根据微小核糖核酸(miRNA)设计的ShRNA，或基于siRNA的ShRNA在体内都表现出有效地基因抑制作用，效果较别的siRNA方法更好。ShRNA的常规制备方法主要有两种体外转录合成ShRNAs法和编码ShRNA的转录DNAs法。

应用^[8][9]

可用于非编码RNA克隆分析及其功能初步研究：

不编码蛋白质的RNA分子—非编码RNA(noncoding RNA,ncRNA)被大量发现,与已知的mRNA、rRNA及tRNA不同,它们不直接参与蛋白质的合成。非编码RNA在各种生物中广泛存在,它的种类繁多,主要包括:类mRNARNA、microRNA(miRNA)、snRNA、snoRNA、scRNA、pRNA、SRP-RNA、gRNA等。非编码RNA可影响转录及染色质的结构,参与RNA的加工修饰,调节mRNA的稳定性及翻译,还可以影响蛋白质的稳定和转运。

ncRNA以多种机制发挥这些作用,如:RNA-RNA(DNA)碱基配对、RNA-蛋白质相互作用、模拟其他核酸分子或直接起催化作用。microRNA及类mRNA RNA是两类非常重要的非编码RNA分子,已有的研究结果表明它们与细胞的生长和分化、胚胎的发育、肿瘤的形成和抑制都有着密切的关系。本论文对这两种非编码RNA分别在发育、肿瘤及衰老过程中的作用进行了初步研究。 microRNA是一类20-25个碱基可调控其他基因表达的小分子非编码RNA,它广泛存在于各种真核生物中。

参考文献

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