破膜剂的应用

背景^[1-6]

破膜剂用于细胞内细胞因子染色前对细胞膜的处理。固定剂起稳定细胞膜、保持细胞膜表面抗体与抗原结合的作用；破膜剂使流动的、完整的细胞膜产生小孔以利于抗体进入细胞。用流式细胞仪检测细胞内抗原及DNA时，对待测细胞进行固定、破膜处理后，加入相应抗体或检测试剂，孵育一定时间即可上机分析。细胞破壁技术一种高科技手段，其应用十分广泛。除病毒外，一切生物均由细胞构成，根据细胞内核结构分化程度的不同，细胞可以分为原核细胞和真核细胞两大类型。

细胞壁（cellwall）是细胞的外层，在细胞膜的外面，细胞壁之厚薄常因组织、功能不同而异。植物、真菌、藻类和原核生物都具有细胞壁，而动物细胞不具有细胞壁。细胞壁本身结构疏松，外界可通过细胞壁进入细胞中。

破膜主要分为以下几步：

（1）用醛类（多聚甲醛、甲醛、戊二醛）或有机溶剂（甲醇、乙醇、丙酮）固定或稳定细胞膜。醛类在固定的同时可以增加细胞渗透性，但还不足以使抗体进入。但如果用有机溶剂固定，那么后续的破膜就不需要了。

（2）用去污剂或溶剂破膜。

（3）将细胞与胞内抗体或标记物孵育。

常用的破膜方法主要包括：

（1）有机溶剂：例如甲醇、丙酮等，这类溶剂主要通过溶解膜脂质、凝结膜蛋白实现固定和破膜。

（2）去污剂：这类试剂可在胞膜上形成一个孔实现破膜。

细胞免疫荧光的详细操作步骤：

1，取出细胞爬片放到35mm或60mm用过的细胞培养皿里，PBS洗三遍。注意有的时候作的细胞爬片可能比较小，因此夹取的时候要小心。

2，4%多聚甲醛固定20分钟，PBS洗三遍。

3，0.2%Triton X 100通透10分钟，PBS洗三遍。

4， 与二抗相同宿主的血清封闭30分钟，PBS洗三遍。

5，一抗4度湿盒内过夜，也可37度2小时，感觉前者效果好，PBS洗三遍。

6，二抗室温2小时，或者37度1半小时，PBS洗三遍。

7，用DAPI染核，然后直接照荧光片。

8，蒸馏水洗掉PBS，甘油封片，指甲油封片子的四周。

应用^[7][8]

可用于流式细胞术检测儿童白血病细胞磷酸化信号蛋白的初步研究：

采用Phospho-flow技术检测初诊儿童白血病细胞磷酸化蛋白即P-AKT、P-ERK1/2和P-STAT1、P-STAT3、P-STAT5、P-STAT6的表达,分析PI3K/AKT、RAS/RAF/MEK/ERKJAK/STAT通路与患儿危险分型、药物治疗反应之间以及急性淋巴细胞白血病(Acute lymphoblastic leukemia ,ALL)高危分型之间的关系,探讨Phospho-flow技术的临床应用价值。

目的1.在本实验室建立流式细胞术检测白血病患儿骨髓或外周血细胞磷酸化信号蛋白的磷酸化流式细胞技术;2.采用磷酸化流式细胞术检测白血病患儿骨髓或外周血白血病细胞内信号通路磷酸化蛋白的表达,了解儿童白血病细胞内磷酸化蛋白P-ERK1/2、P-AKT、P-STAT1、P-STAT3、P-STAT5和P-STAT6的表达,分析PI3K/AKT、RAS/RAF/MEK/ERK、JAK/STAT通路与患儿危险分型、药物治疗反应之间以及ALL高危分型之间的关系,探讨Phospho-flow技术的临床应用价值。

参考文献

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[2]Relapsed acute lymphoblastic leukemia: Current status and future opportunities[J] . Theresa M. Harned,Paul S. Gaynon.  Current Oncology Reports . 2008 (6)

[3]Exploiting Signal Transduction Pathways in Acute Myelogenous Leukemia[J] . Alexander E. Perl,Martin Carroll.  Current Treatment Options in Oncology . 2008 (4)

[4]Intranuclear 3′-phosphoinositide metabolism and Akt signaling: New mechanisms for tumorigenesis and protection against apoptosis?[J] . Alberto M. Martelli,Irene Faenza,Anna Maria Billi,Lucia Manzoli,Camilla Evangelisti,Federica Falà,Lucio Cocco.  Cellular Signalling . 2006 (8)

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[7]Single Cell Profiling of Potentiated Phospho-Protein Networks in Cancer Cells[J] .   Cell . 2004 (2)

[8]李华梅. 流式细胞术检测儿童白血病细胞磷酸化信号蛋白的初步研究[D].广州医学院,2011.