尿促卵泡素的制备

背景及概述^[1-2]

随着现代社会的迅速发展，不育症的发病率正逐年提高，目前约有15%的育龄期夫妇面临生育难题，并且有不断增加趋势。少弱精子症是男性不育最常见的病因，其中严重少弱精子症的发病机制尚未完全明确，且有明确疗效的药物仍不多见，是临床医生最为棘手的问题之一。众所周知，促卵泡刺激素（folliclestimulatinghormone，FSH）在调节和维持人类生精过程中的必要性，FSH在维持支持细胞功能以及精子发生过程中起着重要作用。

尿促卵泡素（urineFollicleStimulatingHormone，u-FSH）是主要成分为卵泡刺激素（FollicleStimulatingHormone，FSH）的组合物，高纯度尿促卵泡素中FSH含量可以达到95%以上，几乎不含黄体生成素（LuteotropicHormone，LH）。FSH是一种糖蛋白激素，分子量约为30KD。FSH能促进颗粒细胞增生，刺激类固醇生成，调节配子细胞的发育和成熟，是下丘脑-垂体-性腺轴中的主要激素之一。

FSH对人类具有调控月经周期、排卵和调节雄性睾丸功能的作用，临床上常用它治疗女性不孕症和男性促性腺激素分泌不足、精小管缺陷等。在人的脑垂体和绝经期与绝经后的妇女尿中两者的含量较高，因此也是提取FSH的主要来源。用于生产u-FSH的原料人绝经期促性腺激素（HumanMenopausalGonadotropin，HMG）主要包含卵泡刺激素与黄体生成素（LuteotropicHormone，LH）。FSH与LH效价的比值约为1：1。制备高纯度尿促卵泡素需要除去HMG中的LH和其他尿蛋白质，保留高纯度单一活性组分的FSH。

作用与用途^[3-4]

尿促卵泡素（urineFollicleStimulatingHormone，u-FSH）中卵泡刺激素（folliclestimulatinghormone，FSH）的主要生理功能是促进卵泡的各种细胞生长、发育：促进卵泡细胞周围间质细胞分化为内、外两层泡膜细胞并合成黄体生成素（leuteinizinghormone，简称LH）受体；促进卵泡颗粒细胞增生和颗粒细胞内的芳香化酶系统活化，使雄激素转化为雌激素；促进卵泡液分泌，使卵泡细胞逐渐增大。FSH主要针对排卵障碍引起的不孕症，并广泛应用于人工受精、试管婴儿等辅助生育技术中。本品与HMG不同，只含有FSH，不含LH。FSH主要在月经前半期刺激卵泡生长、发育、成熟，也需适量的LH参与。本品适用于FSH不足而LH并不缺乏的不排卵患者。

用法^[3]

本品系冻干粉，用配备的溶剂溶解后肌注。月经周期第6日开始每日注射1支(75U)，根据B超监测卵泡发育情况、尿或血雌激素测定水平决定用药，一般用8～10日。当卵泡接近成熟应停药。次日用HCG5000U肌注，一日1次，共2日。

不良反应与注意事项^[3]

必须在有经验的妇科医师指导下及有良好的监测条件下使用。少数妇女注射局部有反应，发热或关节疼痛。妊娠期，卵巢或子宫发育不全，卵巢功能早衰，高促性腺激素的卵巢功能低下，不明原因子宫出血以及有卵巢肿瘤、子宫肿瘤和乳腺肿瘤的患者忌用。

制剂^[3]

针剂：每支含FSH75U、150U，配有溶液。

制备^[2，4]

方法1：一种尿促卵泡素的制备方法，制备方法操作简便、生产成本低，获得的尿促卵泡素纯度更高，无外源蛋白的污染。FSH比活性大于10000IU/mg蛋白质，LH：FSH效价低于1：100。制备方法包括以下步骤：

(1)人绝经期促性腺激素粗制品经阴离子交换层析纯化，得到尿促卵泡素中间体I；

(2)尿促卵泡素中间体I经阳离子交换层析纯化，得到尿促卵泡素中间体II；

(3)尿促卵泡素中间体II经染料亲和层析纯化，得到尿促卵泡素中间体III；

(4)尿促卵泡素中间体Ⅲ经疏水层析纯化，得到高纯度尿促卵泡素的溶液；

方法2：一种高比活尿促卵泡素的制备方法，所述的高比活尿促卵泡素的比活≥10000国际单位/mg蛋白；：所述的制备方法步骤为：

步骤1、在20—60g的低纯度尿促性素中加入pH值为7.4的TrisHCl平衡液，制得5—15L的混合液，后将混合液通过5L的抗黄体生成素抗体凝胶柱，收集吸附后的液体，得到吸附液，后用20—60L的pH值为7.4的TrisHCl平衡液进行洗脱，收集洗脱液Ⅰ，后将洗脱液Ⅰ和吸附液，得到混合液，后将混合液通过截留分子量为10KD的超滤膜进行纯化、浓缩，得到5—15L的浓缩液，备用；

步骤2、用浓度为10%的氢氧化钠将步骤1中浓缩液的pH值调至7.8，后将pH值为7.8的浓缩液Ⅰ通过5L的阴离子交换色谱，用20—30L的pH值为7.8的TrisHCl平衡液进行洗脱，收集洗脱后的液体，将洗脱后的液体放置在280nm处的紫外分光光度计进行检测，当OD值为0.002时，收集洗脱液Ⅱ，将洗脱液Ⅱ通过截留分子量为10KD的超滤膜进行纯化、浓缩，得到5—15L的馏分Ⅰ，备用；

步骤3、用浓度为10%的醋酸将步骤2中馏分Ⅰ的pH值调至4.8，后将pH值为4.8的馏分Ⅰ通过2L的阳离子交换色谱，用pH值为4.8的TrisHCl平衡液洗涤阳离子交换色谱柱，弃去洗涤后的液体，后用pH值为4.5、浓度为0.3mol/L的醋酸铵洗脱阳离子交换色谱柱，收集洗脱后的液体，将洗脱后的液体放置在280nm处的紫外分光光度计进行检测，当OD值为0.002时，收集洗脱液Ⅲ，将洗脱液Ⅲ通过截留分子量为10KD的超滤膜进行纯化、浓缩，得到2—6L的馏分Ⅱ，备用；

步骤4、用浓度为10%的氢氧化钠将步骤3中馏分Ⅱ的pH值调至9.5，后将pH值为9.5的馏分Ⅱ通过蓝色琼脂糖凝胶染料亲和色谱，后用pH值为9.5、浓度为0.1mol/L的氯化钠洗涤蓝色琼脂糖凝胶染料亲和色谱，弃去洗涤后的液体，再用浓度为3mol/L的氯化钠溶液洗脱蓝色琼脂糖凝胶染料亲和色谱柱，收集洗脱后的液体，将洗脱后的液体放置在280nm处的紫外分光光度计进行检测，当OD值为0.002时，收集洗脱液Ⅳ，将洗脱液Ⅳ通过截留分子量为10KD的超滤膜进行纯化、浓缩，得到2L的馏分Ⅲ，备用；

步骤5、将步骤4中的馏分Ⅲ用无水乙醇进行沉淀、脱水，得到产品；

主要参考资料

[1] 注射用尿促卵泡素治疗严重少弱精子症的多中心临床研究

[2] CN201610528438.6一种高纯度尿促卵泡素的制备方法

[3] 临床实用药物手册

[4] CN201210414154.6一种高比活尿促卵泡素的制备方法