肌氨酸氧化酶的制备及应用

背景及概述^[1][2]

肌氨酸氧化酶（sarcosine oxidase，E.C.1.5.3.1）简称SOX，是肌酐降解代谢途径中的第三个酶，能专一性地催化底物肌氨酸生成甘氨酸。微生物是肌氨酸氧化酶最为主要的来源，其在临床诊断中有广泛的应用，通过肌氨酸氧化酶偶联肌酐酶、肌酸酶测定血清中肌酐的含量，是判断肾脏功能的一个重要参考指标，在医药领域具有良好的应用前景。

制备^[1]

一种制备肌氨酸氧化酶的方法。 这种方法的原理主要在于：将优化后的肌氨酸氧化酶编码基因插入构建好的表达载体，在大肠杆菌中诱导其高效表达，该方法具体为：

1.肌氨酸氧化酶表达载体的构建：

通过基因工程手段利用NdeI和Xho I位点将其克隆至PRSF Duet载体内， 并转化大肠杆菌TOP10菌株，挑取数个转化克隆提取质粒，通过限制性内切酶 酶切鉴定目的基因是否插入载体(图1所示)，选取插入目的基因的质粒进行 DNA序列测定，结果表明肌氨酸氧化酶基因成功克隆至pRSF Duet载体内，将其命名为SAO pRSF。

2.肌氨酸氧化酶的表达：

1)以BL21(DE3)为宿主菌，将SAO pRSF进行转化，挑取单菌落于3ml LB培养基培养过夜；

2)以1∶500比例将菌液转接至400ml LB培养基，恒温在37℃，230rpm培 养至OD600＝0.4‑0.6；

3)加IPTG诱导，IPTG诱导终浓度为0.5mM，保持25℃条件下表达8小 时后收菌。

BL21(DE3)菌株用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体(如 pET系列)的基因。普通大肠杆菌没有t7 RNA聚合酶，所以不能表达那些载体 上的基因。λ噬菌体DE3区含有T7噬菌体RNA聚合酶，该区整合于BL21的 染色体上，就叫BL21(DE3)。

3.肌氨酸氧化酶的纯化：

1)取400ml培养液3000rpm离心分离10分钟后收集菌体，菌体重悬于 10ml蛋白提取缓冲液中(50mM Na‑PO4，pH8.0，500mM NaCl，10mMImidazle)， 15MPa高压破菌，12,000rpm，4℃离心10min，上清液与Ni‑NTA冰上孵育1小 时；

2)过Ni‑NTA亲和层析柱，用蛋白提取buffer洗涤，最后用250mM Imidazle 洗脱，收集洗脱液。

3)蛋白洗脱液过G50柱去除Imidazle，这样可以得到95％以上纯度的 SAO(图2所示)。

4.肌氨酸氧化酶活性测定：

制备肌氨酸氧化酶的纯品用奥林巴斯AU5400生化仪测定活性，酶活可达 30000U/L，且‑20℃甘油冻存6个月，酶活基本保持不变。

上述制备肌氨酸氧化酶的方法可作为诊断试剂，用于肌氨酸检测试剂盒的 研制。

提高稳定性^[2]

由于肌氨酸氧化酶在保存、运输过程中易失活，因此提高其稳定性是该酶大量应用的基础。目前，提高酶稳定性方法主要有，蛋白质工程、固定化、添加保护剂、化学修饰等，其中固定化是较为常用的方法。戊二醛作为双功能试剂，广泛应用于酶固定化中，但考虑到操作复杂且试剂具有毒性，CN201310301117.9中使用碳二亚胺法固定肌氨酸氧化酶，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)是一种将氨基和羧基偶联的缩合剂，酶分子羧基被碳二亚胺活化，生成中间产物，该产物再与氨基载体反应形成结合物。

CN201310301117.9提供一种提高肌氨酸氧化酶稳定性的方法，以多聚赖氨酸poly-lysine为氨基载体，选用1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺EDC为交联剂，对肌氨酸氧化酶进行固定化处理，固定化条件为：酶分子表面羧基与载体氨基摩尔比1:10-80，酶分子表面羧基与EDC摩尔比为1:1-2，固定化pH为6.5-8.0，固定化温度为4-10℃，50 r/min固定化时间为16-20h。

优选的固定化条件为：酶分子表面羧基与载体氨基摩尔比1:50，固定化pH为6.5。

在固定化之前需要研究肌氨酸氧化酶分子表面酸性氨基酸数目，所述单个肌氨酸氧化酶分子表面酸性氨基酸数目为49个。

较佳地，固定化处理以多聚赖氨酸为氨基载体。

较佳地，氨基载体的氨基密度为27mol/g。

较佳地，所述酶分子表面羧基与载体氨基摩尔比1:50，酶分子表面羧基与EDC摩尔比为1:2，所述固定化pH为6.5。

应用^[3]

CN201611080806.1涉及一种用于肌氨酸的电化学检测方法，包括：利用物理吸附或者化学偶联的方法将肌氨酸氧化酶和核酸序列连接；将过氧化物酶和第二核酸序列连接；提供核酸纳米结构，其上伸出识别序列；提供第二核酸纳米结构，其上伸出第二识别序列；核酸序列修饰酶与识别序列杂交，得到肌氨酸氧化酶和核酸纳米结构的复合体，第二核酸序列修饰酶与第二识别序列杂交，得到过氧化物酶和核酸纳米结构的第二复合体；将复合体和第二复合体组装到电化学装置的工作电极表面，进行电化学检测。根据本发明的电化学检测方法将结构核酸纳米技术、酶催化反应和电化学生物传感器相结合，实现了对肌氨酸小分子的定量检测。

主要参考资料

[1] CN201210578481.5 一种制备肌氨酸氧化酶的方法及应用

[2] CN201310301117.9 一种提高肌氨酸氧化酶稳定性的方法

[3] CN201611080806.1一种用于肌氨酸的电化学检测方法