鸡肿瘤坏死因子Α(TNF-Α)ELISA试剂盒——鸡TNF-α的定量工具

肿瘤坏死因子α（TNF-α，中文文献常写作“肿瘤坏死因子A”）主要由巨噬细胞和单核细胞产生，是重要的炎性细胞因子。在禽病研究中，它既是关节炎、包涵体肝炎等模型的炎症指标，也被当作免疫功能的读出信号。鸡肿瘤坏死因子Α(TNF-Α)ELISA试剂盒是用于体外定量检测鸡血清、血浆、组织匀浆及细胞培养上清等样本中TNF-α含量的科研工具，其检测原理同样基于双抗体夹心法或竞争法。

2003年的研究中，以8周龄健康肉鸡60只（试验组45、对照组15）为对象，关节腔注射2.5×10⁹ CFU鸡源致病性金黄色葡萄球菌复制关节炎模型，接种前后分9个时间点翼静脉采血并冻存血清，其中TNF-α检测使用TNF-Α ELISA试剂盒^[1]。结果显示TNF-α在接种后前5 d略降、5 d后迅速上升，第14天达峰值，第5、7、14天与对照组差异极显著（P<0.01）^[1]。当时对鸡的细胞因子仍无特异性的活性检测方法，本试验是试图用人的细胞因子检测试剂盒来检测鸡的细胞因子，依据是鸡TNF-α与人TNF-α可能存在同源性^[1]。这是早期鸡肿瘤坏死因子A(TNF-A)ELISA试剂盒的使用场景：先借用，再解释。

2005年有研究用FAV-Hb株经口感染1日龄SPF雏鸡80只（实验组48、对照组32），在感染后第1至56天分16个时间点采样，测外周血与脾脏的TNF-α活性^[2]。方法为L929细胞微量细胞病变法：样品倍比稀释至2¹~2⁸，每个稀释度8孔、每孔100 μL，再加入细胞悬液100 μL，37 ℃培养20 h，中性红染色后于A490 nm读取吸光度，并以50%细胞死亡率的10倍稀释的对数值定义为TNF-α活性单位^[2]。结果外周血第41至56天的活性单位为1.01~1.50，脾脏同期为0.31~0.42，此前各点均小于0.3^[2]。本研究中的活性法读的是生物学效应，它研究的是有多少活性，与鸡肿瘤坏死因子A(TNF-A)ELISA试剂盒给出的质量浓度属于两套量纲。

2011年有研究从鸡盲肠扁桃体克隆TNF-α的CDs保守区，与pGEX-6p-1连接后转化大肠杆菌，经IPTG诱导获得以包涵体形式存在的GST-ChTNF-α融合蛋白，分子量43.05 kDa，经尿素梯度复性与Sepharose 4B亲和层析纯化。Western blot鉴定使用的是鼠抗GST单克隆抗体（GST Ab-1，Novagen），而非识别鸡TNF-α自身序列的抗体^[3]。活性方面，CEF/VSV细胞病变抑制法把抑制50%细胞病变的最高稀释度定为1个TNF单位，测得抗病毒活性为1.2×2⁶ U/mg。MTT法显示各稀释度增殖指数均大于1（P<0.01）^[3]。该研究为后续定量检测储备了可复性重组蛋白。对鸡肿瘤坏死因子A(TNF-A)ELISA试剂盒而言，重组蛋白正是标准品与校准曲线的物质基础。

陈丽娜在2021的论文中把检测推进了一步：按已公布的鸡TNF-α序列（GenBank MF000729）对胞外区做密码子优化，构建pET-45b(+)-His-chTNF-α并转化大肠杆菌Rosetta株，于0.1 mM IPTG、18 ℃诱导12 h可溶表达，经Ni-NTA亲和柱纯化获得26 kDa重组蛋白^[4]。以此蛋白免疫新西兰兔与6周龄BALB/c小鼠，获得兔多抗与10株单抗，其中3E9被选作检测抗体。分段表达试验显示，各单抗识别的表位集中在195-285 aa区间^[4]。最终以兔多抗（10 μg/mL）捕获、3E9（1:400）检测建立抗原捕获ELISA，最低检测浓度1 ng/mL，并检出刺激后脾脏细胞上清中的天然chTNF-α^[4]。这表明，商品化鼠源试剂盒检测范围为31.25~1000 pg/mL、人源为7.81~500 pg/mL，但禽类基因与哺乳动物类同源性低，不能用来做chTNF-α的检测^[4]。因此鸡肿瘤坏死因子A(TNF-A)ELISA试剂盒必须以鸡源抗体对为核心的原因。

选型上，综合四篇来看，鸡TNF-α的读出尺度依次是人源试剂盒的浓度读数、L929细胞法的活性单位、融合蛋白的比活性（U/mg）、鸡源抗体对的质量浓度（ng/mL）[1-4]。四者不是同一把尺子的不同刻度，不能互相换算，跨研究比较必须回到检测原理与试剂来源。物种匹配应排在鸡肿瘤坏死因子A(TNF-A)ELISA试剂盒选型的第一条。免疫原的序列来源决定抗体能否识别禽源靶蛋白。其次看抗体对，捕获与检测抗体的组合方式直接决定灵敏度与背景，该研究中10株单抗只有部分适合用作检测抗体，说明选型需实际滴定。再次看标准品溯源与检出下限。最后看基质适用性与特异性对照。操作上，采血后及时分离血清并低温保存，避免反复冻融。同批检测保持封闭条件与孵育温度一致。

参考文献

[1] 程国富, 谷长勤, 胡薛英, 等. 实验性鸡葡萄球菌性关节炎的发病机制——血清肿瘤坏死因子α、白细胞介素6和类风湿因子的动态变化[J]. 中国兽医学报, 2003, 23(5): 457-459.

[2] 王凤龙, 赵满达. 鸡包涵体肝炎肿瘤坏死因子α的动态变化与病变相关性的研究[J]. 中国预防兽医学报, 2005, 27(3): 184-189.

[3] 王黎霞, 王彩霞, 张建军, 等. 鸡肿瘤坏死因子-α原核表达及生物活性鉴定[J]. 中国兽医杂志, 2011, 47(11): 6-9.

[4] 陈丽娜. 鸡肿瘤坏死因子α单克隆抗体制备及抗原捕获ELISA方法的建立[D]. 扬州: 扬州大学, 2021.